RNA二级结构与FUBP1在剪接反应中功能的研究以及SRSF10在脂肪细胞分化过程中功能的研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 李璜 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2013-07 |
| 授予单位 | 中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所 |
| 授予地点 | 中国科学院上海生命科学研究院 |
| 导师 | 冯英 |
| 关键词 | RNA剪接 FUBP1 RNA二级结构 SRSF10 脂肪细胞分化 |
| 其他题名 | Investigation of RNA secondary structure and FUBP1 in splicing regulation & Functional studies of the role for SRSF10 in adipogenesis |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 中文摘要 | 第一部分中文摘要RNA二级结构与FUBP1在剪接反应中功能的研究李璜（生物化学与分子生物学）导师：冯英 研究员RNA剪接是衔接转录与翻译过程的桥梁，mRNA前体经过剪接将内含子去除，外显子相互连接起来，形成可供蛋白质翻译的成熟mRNA。在真核生物中，mRNA前体被剪接成为成熟的mRNA一般需要经历两步转酯反应来完成。在剪接反应被开启后，此两步转酯反应往往是紧密偶联的。然而，前期报道发现了一种特殊的mRNA前体，该前体在剪接反应已经开启的情况下，仅将转酯反应进行到第一步即停止，第二步反应则被完全抑制。在此，我们通过运用多种相关技术手段，揭示了造成第二步剪接反应抑制的两种不同机制。通过RNA二级结构模拟软件，我们发现该前体第二个外显子紧邻3’剪接位点处的RNA序列会在内部形成稳定的茎环结构，该结构会显著抑制第二步剪接反应的发生。在体外剪接反应和细胞水平剪接反应的实验中，人为删除或破坏该茎环结构可以使此mRNA前体进行有效的第二步剪接反应；而在原本可以正常剪接的mRNA前体的3’剪接位点之后添加类似茎环结构可以显著抑制剪接反应的进行。除此之外，我们还发现第二个外显子的序列中存在一段剪接沉默子（ESS）元件，实验证明，单链核酸结合蛋白FUBP1可以有效结合至此ESS元件，并且抑制第二步剪接反应的发生。在体外剪接环境中降低FUBP1的蛋白质水平可以促进该特殊mRNA前体发生第二步剪接反应的效率。而在细胞水平上改变FUBP1的含量不仅会影响该特殊mRNA前体的剪接，还会改变一系列内源mRNA前体的剪接模式。综上所述，我们的研究结果提出了RNA二级结构调控RNA剪接的新模式，并首次证明单链核酸结合蛋白FUBP1也具有调控剪接反应的活性。第二部分中文摘要SRSF10在脂肪细胞分化过程中功能的研究李璜（生物化学与分子生物学）导师：冯英 研究员RNA的选择性剪接是蛋白质多样性的保证。在真核生物中，一种mRNA前体经过选择性剪接往往可以产生多种外显子组成不同的成熟mRNA，这些mRNA经过翻译产生结构不同的蛋白质，发挥着不同的生理功能。选择性剪接在疾病发生发展及机体的发育过程中扮演着重要的角色，多个剪接因子已被证明参与到这些过程中并起到关键作用。本研究所关注的SRSF10就是这样一个剪接调控因子，它属于SR剪接调控蛋白（serine/arginine -rich splicing factors）家族，一般表现出序列依赖性的剪接促进活性。在之前的报道中，SRSF10已被证明可以显著影响小鼠胚胎期的肝脏和心脏发育，SRSF10敲除小鼠会于出生前死亡。在本研究中，我们发现SRSF10敲除小鼠胚胎的皮下白色脂肪组织发育也受到了显著的抑制。通过来源于SRSF10敲除小鼠的原代MEF细胞及SRSF10敲减C3H10T1/2细胞系的分化实验，我们发现SRSF10对脂肪细胞的分化起着非常关键的作用。我们运用高通量转录组测序的技术检测并分析了野生型MEF细胞及SRSF10敲除MEF细胞之间选择性剪接的差异情况，并对部分分析结果进行了验证。在这些验证的结果中，我们发现Lipin1基因的???剪接异构体比例不仅在野生型MEF细胞及SRSF10敲除MEF细胞中出现了显著差异，在整个脂肪细胞分化过程中也会发生明显的变化。Lipin1是脂素（Lipin）家族的一员，在脂肪代谢和脂肪组织发育中发挥着十分重要的功能，Lipin1敲除小鼠表现出严重脂肪组织发育不良。另外，由于已有报道显示Lipin1两种异构体的差异会造成它们在细胞内定位不同，在脂肪细胞分化过程中扮演的角色也不尽相同，所以我们决定重点关注SRSF10是否确实通过调控Lipin1???的选择性剪接影响脂肪细胞分化。通过对Lipin1 minigene的一系列突变mapping及剪接情况的观察分析，我们证明SRSF10可以结合到Lipin1的8号外显子上，抑制7号外显子的剪接接入，从而达到调控Lipin1???剪接异构体比例的效果。在SRSF10敲减的C3H10T1/2细胞内回补Lipin1?异构体可以显著的恢复其向脂肪细胞分化的能力，进一步证明了SRSF10可以通过调控Lipin1???剪接异构体的比例，影响脂肪细胞分化的能力。 |
| 索取号 | D2013-063 |
| 英文摘要 | Abstract of the first partBinding of FUBP1 to an exonic splicing silencer and RNA secondary structure mediate second-step splicing repression Huang Li (Biochemistry and Molecular Biology) Mentor: Dr. Ying FengSplicing of mRNA precursors consists of two steps that are almost invariably tightly coupled to facilitate efficient generation of spliced mRNA. However, we described previously a splicing substrate that is completely blocked after the first step. We have now investigated the basis for this second-step inhibition, and remarkably elucidated two independent mechanisms. One is a stem-loop structure located downstream of the 3’splice site, while the other is an exonic splicing silencer (ESS) situated 3’ to the structure. We provide evidence that both elements contribute to the second-step block in vitro, and also cause exon skipping in vivo. Importantly, we identified FUBP1, a single-stranded DNA and RNA binding protein not previously implicated in splicing, as a strong ESS binding protein, and several assays implicate it in ESS function. We demonstrate using depletion/add-back experiments that FUBP1 acts as a second-step repressor in vitro and show by siRNA-mediated knockdown that it modulates exon inclusion in vivo. Together, our results provide new insights into splicing control, and identify FUBP1 as a novel splicing regulator.Abstract of the second partThe splicing factor SRSF10 regulates Lipin1 ????alternative splicing during adipogenesisHuang Li (Biochemistry and Molecular Biology) Mentor: Dr. Ying FengAlternative splicing plays an important role in disease and development, many splicing factors were proved to have vital importance in these processes. Among this is SRSF10, a atypical SR protein which was reported to impact on liver and heart deveploment in mouse embyos. We report here that SRSF10-knockout mice have imparied development of subcutaneous white adipose tissue at embryonic day E18.5. We further observed that SRSF10-deficient MEF cells display severe adipgogenic defects, and those defects are reproduced in another cell line C3H10T1/2 by knockdowning SRSF10 expression. In order to understand the molecular mechanism uderlying the observed defective adipogeneis, we took RNA-seq approach to identify alternative splicng events regulated by SRSF10 in MEF cells. We found that SRSF10 depletion causes inclusion of Lipin1 alternative exon7, leading to decreased level of exon7-lacking lipin1α and increased level of exon7-containing Lipin1? in undifferentiated KO MEF cells. By analyzing in vivo splicing of a series of Lipin1 minigene derivatives, we provided strong evidence that SRSF10 control alternative exon 7 exclusion by specifically binding to its downstream constitutive exon 8 and thereby decreasing the competitiveness of the competing alternative sites. More importantly, exogenous expression of lipin1α could partially rescue defects in adipogenesis observed in C3H10T1/2 cells upon SRSF10 knockdown, further underscoring the importance of SRSF10-regualted Lipin1?????alternative splicing during adipogenesis. |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2015-12-24 |
| 源URL | [http://202.127.25.144/handle/331004/383]  |
| 专题 | 中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所_代谢性疾病的基因表达调控研究组 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李璜. RNA二级结构与FUBP1在剪接反应中功能的研究以及SRSF10在脂肪细胞分化过程中功能的研究[D]. 中国科学院上海生命科学研究院. 中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所. 2013. |
入库方式： OAI收割
来源：上海营养与健康研究所
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