里氏木霉内切纤维素酶Cel5A热稳定性研究及蛋白内部堆积作用的探索
文献类型：学位论文
| 作者 | 何春燕 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2015-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 姚礼山 |
| 关键词 | 里氏木霉Cel5A CD 稳定性 离子残基 π-π堆积 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 中文摘要 | 里氏木霉内切纤维素酶Cel5A (Trichoderma reesei Cel5A, Tr. Cel5A) 占整个内切酶活性的大部分，在与其他酶协同作用水解纤维素的过程中起着关键作用。目前，Tr. Cel5A的催化域(Tr. Cel5A CD)晶体结构已经得到解析，这对于进一步研究该酶的性质提供了结构基础。本论文综合运用了分子生物学技术、蛋白质生化技术及MD计算模拟对Tr. Cel5A CD进行了以下研究： （1） 提高Tr. Cel5A CD热稳定性的探索 首先通过MD模拟筛选出理论上稳定性提高的突变体，利用定点突变技术对Tr. Cel5A CD进行突变。通过蛋白表达纯化技术及相应的实验对相应的突变体进行表征，获得了N38D, V102I, D217A, D271L和D271M 5个稳定性在不同程度上得到提高的突变体，通过T50来定量各个突变体提高的温度。对以上突变体的活性进行表征，结果显示突变体对酶的活性没有太大影响。 （2） 羧基与肽平面的堆积对于稳定包埋氨基酸E305的重要性 蛋白内部氢键或盐桥的形成通常是稳定包埋的离子残基，但是，Tr. Cel5A CD中D271和E305并没有与周围残基形成氢键或盐桥。当把D271突变为丙氨酸或亮氨酸时，由于去除了天冬氨酸的去溶剂化效应，酶的稳定性得到了提高。然而，对于同类型的突变体E305却导致酶的稳定性降低。对晶体结构分析发现，在E305而非D271上，羧基与肽平面形成堆积作用。量子力学计算表明对于质子化的羧基，平行堆积的相互作用能为−4 kcal/mol，T型堆积的作用能为−7 kcal/mol。对于去质子化羧基，其平行堆积与T型堆积的最大能量相当，为−7 kcal/mol。溶剂化效应弱化了带电系统的相互作用。搜索PDB数据库中羧基与肽平面的堆积显示，T型堆积较少，平行堆积比较普遍，并且形成堆积作用的两部分之间距离的大小与量化计算的预测值相近。这部分工作强调了羧基与肽平面之间的π-π堆积对于稳定蛋白中的天冬氨酸和谷氨酸的潜在作用。 |
| 英文摘要 | Trichoderma reesei (Tr.) Endoglucanase II (EGII) accounts for most of the endoglucanase activity, and has a significant role in the total hydrolysis of cellulose. The crystal structure of Tr. Cel5A CD (EGII) has been reported, which provides the basis for the further research of the enzyme properties. This thesis, focused on the Tr. Cel5A CD research, is divided into two parts: |
| 学科主题 | 仿真模拟 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2015-07-01 |
| 源URL | [http://ir.qibebt.ac.cn/handle/337004/8095]  |
| 专题 | 青岛生物能源与过程研究所_仿真模拟团队 |
| 作者单位 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 何春燕. 里氏木霉内切纤维素酶Cel5A热稳定性研究及蛋白内部堆积作用的探索[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2015. |
入库方式： OAI收割
来源：青岛生物能源与过程研究所
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