多能干细胞特异性基因Filia维持小鼠胚胎干细胞遗传物质稳定性的功能及机制研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 赵博 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2013-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 郑萍 |
| 关键词 | Filia 胚胎干细胞 遗传物质稳定性 ＤＮＡ损伤反映 Ecat1 |
| 其他题名 | Filia, a pluripotent stem cell-specific gene, regulates DNA damage response and maintains genomic integrity in mouse embryonic stem cells. |
| 学位专业 | 细胞 |
| 中文摘要 | 多能干细胞遗传物质的稳定维持是决定它们能否被应用于再生医学的关键。与体细胞相比，多能干细胞具有非常强大的能力维持自身遗传物质的稳定性，但相关机制却远未清楚。对多能干细胞维持自身遗传物质稳定的机制研究有助于我们全面认识多能干细胞的特性，并为胚胎发育研究和再生医学应用提供必要的理论依据。Filia是小鼠胚胎干细胞特异表达的基因，具有物种保守性。根据剪切形式的不同，Filia具有1.2kb和1.6kb两个亚型，分别对应FILIA-50kD和FILIA-70kD蛋白。两种FILIA蛋白在N端的346个氨基酸序列完全一致，而FILIA-70kD蛋白具有独特的C端序列。在本论文中，我们系统地研究了Filia基因在维持小鼠胚胎干细胞遗传物质稳定性和DNA损伤反应调控中的重要功能及机制。 Filia基因对维持小鼠胚胎干细胞遗传物质的稳定至关重要。通过基因敲除、基因敲减和挽救实验，我们发现Filia基因缺失导致胚胎干细胞的遗传物质处于极不稳定的状态。在正常培养条件下，Filia缺失的胚胎干细胞表现为非整倍体的急剧形成、端粒损伤及染色体末端粘连、gama-H2A.X表达量显著升高、有丝分裂后期出现染色质桥和微核、中心体过度复制及纺锤体组装异常。Filia基因缺失使胚胎干细胞发生癌变，致瘤能力显著增强。 进一步研究发现，Filia在遗传物质稳定性维持的重要途径-DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）中起关键作用。DNA损伤诱导细胞内的相关信号传导通路激活、细胞周期阻滞、启动DNA损伤修复和凋亡等，这些过程统称为DDR。胚胎干细胞除了具有与体细胞相似的DDR机制外，在维持自身遗传物质稳定性方面还具有独特的策略，例如胚胎干细胞主要以糖酵解为能量代谢方式，细胞内的活性氧物质（ROS）浓度较低，因此可降低ROS诱导产生的DNA损伤频率；胚胎干细胞可以通过P53抑制Nanog的表达来促进受损个体分化，进而通过凋亡将其清除。FILIA蛋白的表达受DNA损伤诱导。多种类型的DNA损伤（单链DNA损伤、双链DNA损伤和DNA交联）或复制压力均可诱导FILIA蛋白表达量显著升高。通过基因功能缺失及挽救实验，我们发现Filia在DDR的多个环节中起重要作用。在DNA损伤信号传导方面，缺失Filia使DNA损伤信号传导通路关键分子gama-H2A.X、ATM、Chk2和P53蛋白的活化水平和维持能力显著下降。在细胞周期检查点方面，Filia缺失导致胚胎干细胞的S期和G2/M期检查点失活，使受损细胞的细胞周期不能被阻滞。在清除受损个体方面，Filia缺失导致Nanog表达量不能有效下调，且凋亡水平降低，从而使受损干细胞不能通过分化和凋亡被清除。 我们还发现，FILIA蛋白在DDR中的不同功能是通过不同的结构域完成。FILIA蛋白N端1-346氨基酸序列负责ATM的激活和DNA损伤信号传导过程，而C端的347-440氨基酸序列对于调控FILIA蛋白的DNA损伤响应过程是必需的，并且该序列参与调控细胞周期检查点激活，Nanog表达量下调，以及受损细胞的分化和凋亡过程。尽管N端346个氨基酸可以激活ATM，但该序列只能部分地激活S期检查点。S期检查点的完全活化需要FILIA-70kD蛋白全序列的参与。这也表明FILIA-70kD蛋白可通过不依赖ATM的机制参与细胞周期检查点的调控。 FILIA蛋白主要以颗粒状定位于细胞质中。UV诱导的FILIA蛋白存在核质穿梭过程。FILIA蛋白在UV处理后4h时主要定位于胞质，至6h时主要定位于细胞核，而至8h时又定位于胞质。经RNase A处理后FILIA蛋白所形成的颗粒显著减少，表明FILIA蛋白的细胞内分布依赖于RNA，提示Filia可能存在于P-bodies (processing bodies) 或者stress granules结构中，参与特定mRNA的稳定性调控或者翻译调控。 Filia具有物种保守性，人胚胎干细胞表达Filia的同源基因Ecat1。ECAT1蛋白的表达也受DNA损伤调控，DNA 损伤处理可显著提高ECAT1的表达。并且，人ECAT1蛋白可以拯救小鼠Filia敲除胚胎干细胞的部分表型。这提示Filia基因对多能干细胞的遗传物质稳定性维持的功能非常保守。对Filia和Ecat1的进一步深入研究有助于我们深刻认识多能干细胞维持自身遗传物质稳定性的分子机制，并有望为人多能干细胞的安全应用提供理论基础。 |
| 英文摘要 | Genomic stability of pluripotent stem cells is crucial for its potential application in regenerative medicine. Compared to the somatic cells, pluripotent stem cells possess much stronger ability to maintain their genomic stability. However, the underlying molecular basis is far from clear. Filia is specifically and abundantly expressed in mouse growing oocytes and embryonic stem cells (ESCs). Two isoforms of Filia transcripts were generated through alternative splicing. The short isoform encodes protein of 346 amino acids and predominantly expressed in growing oocytes, whilst the long isoform encodes protein with 440 amino acids and expressed in ESCs. Genetic depletion of Filia from oocytes causes aneuploidy in cleavage-stage embryos. However, whether Filia displays similar role in governing genomic integrity of pluripotent stem cells was not investigated. In this work, we studied in detail the roles and the underlying molecular mechanism of Filia in maintaing the genomic stability of mouse ESCs. Our findings demonstrated that Filia was a master regulator of DNA damage response and played crucial roles in preserving genomic integrity of mouse ESCs. By utilizing the approaches of gene knockout, gene knockdown and gene rescue, we provided evidences supporting that Filia was essential to maintain genomic stability of mouse ESCs propagated in normal culture conditions. Upon loss of Filia protein, ESCs displayed various types of genomic instabilities, including aneuploidy, chromosome end-to-end fusion, increases in gama-H2A.X expression indicative of DNA double strand breaks. Moreover, Loss of Filia functions led to tumorigenic transformation of mouse ESCs. DNA damage response (DDR) is a fundamental and evolutionarily conserved mechanism to preserve genomic integrity of the cells. Upon DNA damage induced by endogenous or exogenous insults, cells elicit complicated but highly coordinated processes to recognize the damage, to generate, amplify and transduce the signalings to downstream effectors which in turn trigger multiple reactions including the cell cycle arrest, DNA repair machinery assembly or alternatively cell death if the damage fails to be repaired. Compared to somatic cells, ESCs display unique properties of DDR. For instance, mouse ESCs do not have G1/S cell cycle checkpoint due to the extremely short G1 phase. |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-05-23 |
| 源URL | [http://159.226.149.42:8088/handle/152453/7433]  |
| 专题 | 昆明动物研究所_哺乳动物胚胎发育 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 赵博. 多能干细胞特异性基因Filia维持小鼠胚胎干细胞遗传物质稳定性的功能及机制研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2013. |
入库方式： OAI收割
来源：昆明动物研究所
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