地鳖虫抗血栓蛋白的分离纯化、结构和功能研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 杨海龙 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2011-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 赖仞 |
| 关键词 | 抗栓蛋白 地鳖虫 纤维蛋白（原）水解活性 纤溶酶原激活活性 |
| 其他题名 | Purification, structure and function of anti-thrombosis proteins from the insect of Eupolyphaga sinensis |
| 学位专业 | 动物学 |
| 中文摘要 | 在东亚许多国家，地鳖虫一直被用于溶栓治疗，在中国许多地方，人们将地鳖虫作为一种药用昆虫进行人工饲养。为了鉴定其中的溶栓组分，发掘一些新颖的潜在药用分子，我们对地鳖虫的溶栓分子进行了初步研究。 我们从地鳖虫的中肠部分纯化出一个由226个氨基酸残基组成的溶栓蛋白eupolytin1，BLAST比对表明它是一个新颖的丝氨酸蛋白酶。Eupolytin1能够水解纤溶酶的特异底物T6140和胰酶的底物B3133，表明其具有纤溶酶样活性和胰酶样活性。与纤溶酶一样，eupolytin1能够水解纤维蛋白和纤维蛋白原。1 mg eupolytin1在1.5 h内就能够完全水解20 mg纤维蛋白酶原，与已知的只能部分水解纤维蛋白酶原的α-和（或）β-链的纤溶水解酶不同，eupolytin1能够完全水解纤维蛋白酶原的α-，β-和 γ-链。除了能够“直接的”水解纤维蛋白和纤维蛋白原以外，eupolytin1还能够激活纤溶酶原“间接的”水解纤维蛋白。这两种协同作用显然能够提升eupolytin1的纤溶水解效率，相对目前已知的抗栓药物，这样的双功能抗栓蛋白具有更多的内在优势。 大鼠动静脉旁路血栓形成实验和角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓实验进一步表明，eupolytin1在体内也具有极强的溶栓活性，比对照尿激酶效果还要好。在体内大鼠动静脉旁路血栓形成实验中，eupolytin1和尿激酶的溶栓能力都呈剂量依赖关系，浓度为0.06 mM/kg体重的eupolytin1能够使3.7 ± 0.3 mg的血栓重量减至1 ± 0.2 mg，而相同浓度的尿激酶只能使血栓重量减至1.7 ± 0.3 mg；在角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓实验中，eupolytin1和尿激酶的溶栓能力也呈剂量依赖关系，浓度超过0.04 mM/kg体重的eupolytin1处理48小时后能完全清除角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓。 在兔体内的出血风险评估实验表明，相对尿激酶而言，eupolytin1在高剂量（0.12 mM/公斤体重）时才有少量出血，该剂量为角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓形成实验中完全清除血栓所需剂量的3倍。为了揭示eupolytin1的低出血风险，我们检测了兔血浆中纤维蛋白原的浓度改变。使用eupolytin1样品（0.08 mM/公斤体重）8 h后，纤维蛋白酶原的浓度达到最低，14 h后浓度恢复到正常水平。Eupolytin1独特的动力学特性不但增加了纤溶效率，同时也降低了出血风险。 根据测定的氨基酸序列，从地鳖虫中肠扩增蛋白eupolytin1的编码基因时，我们发现该蛋白的编码基因表现出丰富的多样性。我们共扩增了21条eupolytin1相关的编码基因，GenBank accession Gu187070–Gu18707090。 我们下一步的工作需要进一步研究该溶栓分子的结构和功能关系并评估其作为安全的临床纤溶药物的可行性。 |
| 英文摘要 | The ground beetle of E. sinensis has been used in East Asia as crude drugs for thrombolytic therapy and is presently reared as a medicinal insect in China. In order to identify and characterize the interesting thrombolytic compounds and help in identifying novel thrombolytic candidates, we investigate thrombolytic molecules in the insect of E. sinensis. A thrombolytic protein (Eupolytin1) was purified and characterized from mid-guts of the medicinal insect of E. sinensi. It is composed of 226 aa(GenBank accession Gu187070). BLAST search revealed that it is a novel protein belonging to serine protease family. Eupolytin1 could hydrolyze chromogenic substrates T6140 and B3133, indicating that eupolytin1 contains plasmin- and trypsin-like activities. Similar to plasmin, eupolytin1 contains ability to hydrolyze fibrinogen and fibrin. Eupolytin1 showed strong fibrino(gen)olytic activities; 20 mg fibrinogen could be completely hydrolyzed by 1 mg eupolytin1 during 1.5 h. Different from known fibrino(gen)olytic enzymes which only hydrolyze α- or/and β-chains of fibrinogen, eupolytin1 could hydrolyze α-, β-, and γ-chains of fibrinogen. In addition to directly hydrolyzing fibrin(ogen) (direct-acting) , Eupolytin1 could activate plasminogen to hydrolyze fibrin (indirect-acting). The synergetic action of these two means (direct- acting and indirect-acting) obviously improved the fibrinolysis efficiency of eupolytin 1. Such type of bi-functional agent containing both plasmin- and PA-like activities has more advantages than known anti-thrombosis agents to treat thrombus. |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2011-09-21 |
| 源URL | [http://159.226.149.42:8088/handle/353002/6803]  |
| 专题 | 昆明动物研究所_动物毒素室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 杨海龙. 地鳖虫抗血栓蛋白的分离纯化、结构和功能研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2011. |
入库方式： OAI收割
来源：昆明动物研究所
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