红瘰疣螈皮肤多肽cathelicidin-TV的分离纯化、cDNA克隆、功能分析及促皮肤愈合机理研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 木丽仙 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2013-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 赖仞 |
| 关键词 | 红瘰疣螈 创伤修复 多肽 cathelicidin 细胞增殖 |
| 其他题名 | Purification, cloning, function and promoting wound healing mechanism analysis of cathelicidin-TV fr |
| 学位专业 | 动物学 |
| 中文摘要 | Cathelicidins是动物体内一个具有多种功能的抗菌肽家族，之前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中发现，而cathelicidin-TV是首个在两栖类动物有尾目中发现的cathelicidin多肽。 红瘰疣螈(Tylototriton verrucosus)属于两栖纲有尾目蝾螈科疣螈属，广泛分布于云南西部、广西（桂林），国外分布于泰国北部以及邻近中国的东南亚地区。 在本论文中我们对红瘰疣螈皮肤来源cathelicidins家族的cathelicidin-TV多肽进行了一系列研究。 在本研究中，我们通过凝胶过滤和反相高压液相层析两步，从红瘰疣螈皮肤匀浆物中分离纯化得到了一种有促进细胞增殖活性的小肽，命名为cathelicidin-TV。Edman降解法测得其氨基酸序列为KCVRQNNKRVCK ，共计12个氨基酸。ESI-MS测得其分子量为1473.80 Da。 我们构建了红瘰疣螈皮肤的cDNA文库，并得到了编码cathelicidin-TV前体的cDNA序列。该cDNA序列由438个核苷酸组成，由此推测出来的cathelicidin-TV前体由146个氨基酸残基组成，包括信号肽区、成熟肽区和间隔肽段构成。经Blast搜索发现cathelicidin-TV前体与野猪cathelicidin：PMAP-36前体相似性达43.2%。 我们利用化学合成的方法合成了cathelicidin-TV1(天然多肽)和-TV2（改造多肽），并对它们一些可能存在的生物学功能进行了初步研究。结果表明：cathelicidin-TV1和-TV2没有明显的抗微生物活性。同时cathelicidin-TV1和-TV2的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性不明显。 MTT细胞增殖实验结果显示cathelicidin-TV1和-TV2能促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、小鼠成纤维细胞（NIH3T3）及人永生化表皮细胞（HaCAT）增殖；Matrigel胶体外管腔形成实验结果显示cathelicidin-TV1和-TV2能促进HUVEC在体外形成管腔能力；细胞划痕实验结果显示cathelicidin-TV1和-TV2能促进HaCAT细胞的迁移。这些结果表明它们不同于以往发现的cathelicidins家族抗菌肽，即不具有抗菌活性而具有促进细胞增殖活性。 体外皮肤创伤修复动物实验表明，Cathelicidin-TV1和-TV2显著促进了小鼠皮肤创伤的修复。组织病理学研究结果表明cathelicidin-TV1和-TV2能明显促进肉芽组织的形成，促进成纤维细胞的增殖及毛细血管的生成，促进表皮上皮化。免疫组化结果表明 cathelicidin-TV1和-TV2能促进巨噬细胞在创口的募集，并在创伤愈合中后期促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。 我们用ELISA进一步检测了cathelicidin-TV1和-TV2对细胞增殖相关细胞因子：表皮生长因子(EGF)、白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-6(IL-6)，转化生长因子-β(TGF-β）、肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌的影响，结果显示Cathelicidin-TV1和-TV2能明显促进IL-6，TGF-β的分泌，而对EGF，IL-1，TNF-α的分泌无影响。 Western Blot检测发现 cathelicidin-TV1和-TV2能明显促进ERK的磷酸化，同时抑制p38的磷酸化，且有明显浓度依赖性。Cathelicidin-TV1和-TV2对JNK磷酸化没有显著影响。同时还进一步检测了TGF-β信号通路，发现cathelicidin-TV1和-TV2能明显激活Smad2的磷酸化，而对Smad3无明显激活，对Smad7的表达也无影响。 这些结果表明红瘰疣螈来源的多肽cathelicidin-TV主要通过以下几个方面达到促进创伤愈合的作用：1. Cathelicidin-TV可以直接促进创伤部位血管内皮细胞，成纤维细胞的增殖，从而促进肉芽组织的形成。2. Cathelicidin-TV可以直接促进表皮细胞的增殖和迁移，加快上皮化进程。3. Cathelicidin-TV促进巨噬细胞在创口募集，并分泌大量的TGF-β及其他细胞因子，间接通过TGF-β等细胞因子的作用而促进伤口愈合。4. Cathelicidin-TV可能通过激活MAPK(ERK)通路和TGF-Smad2通路而促进皮肤创伤愈合。 Cathelicidin-TV1和-TV2本身所具有的分子量小，易合成，低成本的特点及动物模型实验中表现出的极佳的治疗效果使其成为外用创伤修复药物开发的优秀模板。 |
| 英文摘要 | Cathelicidins are a family of multi-functional antimicrobial peptides found in mammals, birds, reptiles and fish by far. Cathelicidin-TV is the first cathelicidin found in caudata of amphibia. Tylototriton verrucosus is a kind of tylototriton belonging to amphibia, caudata, salamandridae. It is widely distributed in south of Yunnan, Guangxi, north of Thailand and Southeast Asia region. In this thesis, a series of experiments were carried out to study cathelicidin-TV from T. verrucosus. A novel cathelicidin, named as cathelicidin-TV, was purified from skin of T. verrucosus by gel filtration and RP-HPLC. Edman degradation method was used for the determination of its amino acid sequence. The determined sequence was KCVRQNNKRVCK, composed of 12 amino acid residues. By electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), the molecular mass of cathelicidin-TV was determined to be 1473.8 Da. A 438 bp cDNA sequence encoding the precursor of cathelicidin-TV was cloned from a cDNA library of T. verrucosus skin. |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-07-05 |
| 源URL | [http://159.226.149.42:8088/handle/152453/7556]  |
| 专题 | 昆明动物研究所_动物毒素室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 木丽仙. 红瘰疣螈皮肤多肽cathelicidin-TV的分离纯化、cDNA克隆、功能分析及促皮肤愈合机理研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2013. |
入库方式： OAI收割
来源：昆明动物研究所
浏览0
下载0
收藏0
其他版本
除非特别说明，本系统中所有内容都受版权保护，并保留所有权利。