HIV-1蛋白酶的表达、纯化及其抑制剂体外筛选方法的建立
文献类型：期刊论文
| 作者 | 王云华1,3; 王睿睿1,3; 杨柳萌1; 李健峰2; 徐维明2; 郑永唐[*]1 |
| 刊名 | 中国病毒学
 |
| 出版日期 | 2006 |
| 卷号 | 21期号:2页码:126—130 |
| 关键词 | HIV-1蛋白酶 表达 纯化 抑制剂 |
| 其他题名 | Expression and Purification of HIV-1 Protease and the Establishmentof a Method for Protease Inhibitor Screening |
| 通讯作者 | zhengyt@mail.kiz.ac.cn |
| 合作状况 | 其它 |
| 中文摘要 | 从HIV-1IIIB病毒RNA经RT-PCR得到HIV-1蛋白酶编码序列,克隆到pet28a质粒中构建HIV-1蛋白酶表达载体。阳性克隆转染E.coliBL21DE3,经IPTG诱导,蛋白酶以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白量的40%。包涵体经TritonX-100洗涤后溶解于8M尿素,溶解后的蛋白溶液经sephacyls-200H.R分子筛柱纯化后纯度达到90%以上,收集蛋白酶峰稀释复性并通过超滤进行浓缩。经检测,纯化的蛋白酶具有较高的活性。用荧光标记的蛋白酶底物检测不同浓度indinavir对蛋白酶活性的影响,表明该方法可以用于蛋白酶抑制剂的筛选。 |
| 英文摘要 | HIV-protease coding sequence was amplified from HIV-1ⅢB RNA by one- step RT-PCR. The PCR product was inserted into the pet28a expression vector with an additional ATG start codon before and TAA stop codon after the coding sequence. Positive clone was selected and transformed into E. coli BL21 DE3. Cells were cultured in LB medium and induced by IPTG. The recombinant protease was expressed in the form of inclusion body and was up to 40% of total bacterial protein. The inclusion body was washed by Triton X-100 before dissolved in 8M urea and then applied on sephacyl s-200 H.R column. The purity of the protease reached 90% after purification. Protease fraction was collected and diluted in refolding buffer and left at 4℃ for 24 h. The diluent was concentrated by ultrafiltration. The activity of recombinant protease and the inhibiting effect of indinavir were analyzed by FRET with synthesized fluorescence-labeled peptide. The results above indicates that the method can be used to screen inhibitor of HIV-1 protease. |
| 收录类别 | 其他 |
| 资助信息 | 国家高技术研究发展计划(2003AA219142);国家“十五”科技攻关计划(2004BA719A14);中国科学院知识创新工程(KSCX2-SW-216;KSCX1-SW-11);云南省自然科学基金(2002C0066M);云南省科技攻关计划(2004NG12) |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-08-09 |
| 源URL | [http://159.226.149.42:8088/handle/152453/1113]  |
| 专题 | 昆明动物研究所_分子免疫药理学 |
| 作者单位 | 1.中国科学院昆明动物研究所分子免疫药理学实验室,昆明650223 2.中国医学科学院医学生物学研究所,云南昆明650231 3.中国科学院研究生院,北京100039 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王云华,王睿睿,杨柳萌,等. HIV-1蛋白酶的表达、纯化及其抑制剂体外筛选方法的建立[J]. 中国病毒学,2006,21(2):126—130. |
| APA | 王云华,王睿睿,杨柳萌,李健峰,徐维明,&郑永唐[*].(2006).HIV-1蛋白酶的表达、纯化及其抑制剂体外筛选方法的建立.中国病毒学,21(2),126—130. |
| MLA | 王云华,et al."HIV-1蛋白酶的表达、纯化及其抑制剂体外筛选方法的建立".中国病毒学 21.2(2006):126—130. |
入库方式： OAI收割
来源：昆明动物研究所
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