蒺藜苜蓿花发育基因TCP 和WFL1 的功能分析
文献类型：学位论文
| 作者 | 阳天泉 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2016-11 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 陈江华 |
| 其他题名 | Functional Analysis of Floral Symmetry Development Genes TCP and WFL1 in Medicago truncatula |
| 学位专业 | 植物学 |
| 中文摘要 | 花对称性（Floral Symmetry）是被子植物花结构的典型特性之一，根据其花 冠对称性可分为辐射对称（actinomorphy），两侧对称（zygomorphy）以及不对 称（asymmetry）三种形式。已有研究表明，CYC 同源基因在不同物种都调控两 侧花型发育。在豆科植物百脉根（Lotus japonicus）和豌豆（Pisum sativum）中， CYC 类基因通过复制产生3 个拷贝，它们共同决定豆科植物两侧对称花型背腹 极性的发育。 在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）Tnt1 插入突变体库中，我们筛选到MtCYC1 和MtCYC2 基因突变体。其中MtCYC2 突变体（lob standard 1，ls1）为单位点隐 性突变，表现为背部花瓣上部出现对称凹陷。MtCYC1 突变体（normal petals， npe）花发育与野生型无明显差异。通过遗传杂交获得的纯合双突变体npe/ls1， 背部花瓣内部对称属性消失，其形状和大小类似于内部不对称的侧部花瓣，导致 整个花器官两侧对称形态丢失。基因表达分析显示，MtCYC1 和MtCYC2 具有相 似的表达模式，都在发育的背部花瓣具有最高水平的表达。这些结果表明 MtCYC1 和MtCYC2 是花瓣背部属性建立的关键因子，对背部花瓣属性建立有部 分功能冗余。MtCYC3 在npe/ls1 双突变体中表达较野生型上调，说明MtCYC3 在背部花瓣的表达可能受MtCYC2 和MtCYC1 抑制。为了调查MtCYC1 和MtCYC2 如何维持其在背部花瓣表达，以及它们发挥作用的机制，我们做了进一步研究。 首先在MtCYC2 基因的启动子区域预测到TCP 蛋白的结合位点GGGCCCT，酵 母单杂交结果显示：MtCYC1 和MtCYC2 都能与该靶序列结合。为了进一步证 实MtCYC1 和MtCYC2 调控MtCYC2 基因，我们设计了一个effector-reporter 瞬 时表达系统。将MtCYC2 基因的启动子与荧光素酶基因融合作为reporter，将 MtCYC1 和MtCYC2 分别与CaMV35S 启动子融合作为effector。瞬时共表达实验 显示，MtCYC1 和MtCYC2 都负调控MtCYC2 的表达。酵母双杂交和双分子荧 光互补实验显示，MtCYC1 和MtCYC2 存在相互作用，并且它们自身能够形成 同源二聚体。这些结果表明：MtCYC1 和MtCYC2 以形成同源或者异源二聚体 形式发挥作用。 通过正向遗传学筛选突变体库发现一个新的突变体：5 枚花瓣形态和大小类 似旗瓣（dorsalized petals，dsp1），柱头和雄蕊不能形成野生型弯曲的形态，雄蕊直立散生，不能正常包围柱头。遗传分析表明该突变体是由单位点显性基因控 制。dsp1 突变体表型为所有花瓣背部化，我们猜测DSP1 基因与NPE 和LS1 可 能有调控关系。通过遗传杂交获得dsp1/ls1 双突变体，表型与dsp1 单突变体相 似，说明DSP1 可能是位于LS1 的上游调控因子。qRT-PCR 检测MtCYC 基因在 野生型和dsp1 突变体背景中的表达差异，结果发现：在dsp1 突变体花芽中， MtCYC1 和MtCYC2 表达量都显着上调。MtCYC1 在dsp1/ls1 双突变体中表达上 调。原位杂交也显示：MtCYC1 和MtCYC2 只在野生型背部花瓣表达；而在dsp1 突变体所有的花瓣都有表达。结果说明：DSP1 在花发育早期抑制MtCYC1 和 MtCYC2 的表达；dsp1/ls1 双突变体中可能是MtCYC1 发挥着建立背部花瓣属性 的功能。 植物的表皮蜡质覆盖于植物各器官和组织表面，是植物自我防护的一道屏 障，在植物适应干旱环境及各种非生物和生物逆境中发挥重要的作用。蜡质是特 长脂肪酸链的衍生物，C16 或者C18 脂肪酸在内质网上延伸成特长链脂肪酸。在 模式植物拟南芥中，长链脂肪酸的合成途径以及蜡质合成已有大量研究，而豆科 模式植物蒺藜苜蓿研究较少。本研究在Tnt1 插入突变体库中正向筛选到一个新 的单位点隐性突变体wfl1（winkled flower and leaf 1），花瓣不能正常展开并包裹住雄蕊，只外露出不可育的雌蕊，叶片融合。根据候选基因与突变体的连锁分 析，以及反向筛选该候选基因的突变体，确认突变表型，成功定位wfl1 目的基 因。WFL1 基因编码一类β-酮脂酰-CoA 合酶（KCS），催化长链脂肪酸延长的起 始步骤。该论文对其功能进行了初步研究：扫描电镜显示野生型和wfl1 突变体 叶片表皮蜡质差异很明显，突变体表皮蜡质晶体密度降低，蜡质立体形态变得更 短更薄。TB 测试检测叶片表皮渗透性，结果显示wfl1 突变体叶片比野生型更容 易被染色，说明突变体叶片表皮通透性增加。杂合子自交后正常植物与突变体比 例符合3：1，说明wfl1 是单位点隐性基因控制。以拟南芥21 个KCS 蛋白序列 为探针，在蒺藜苜蓿基因组数据库中得到28 个同源性较高的序列。系统进化树 显示，蒺藜苜蓿的28 个KCS 蛋白在KCS 家族的4 亚类（FAE1-like，FDH-like， CER6，KCS1-like）都有分布，但是分布的数目变化较大。WFL1 与拟南芥FDH 基因（AT2G26250）关系最近，并且wfl1 突变体与fdh 突变表型相似。结果表明，尽管KCS 基因在FDH-like 亚类分化较大，但是基因功能保守。qRT-PCR 检测 WFL1 的表达模式，结果显示WFL1 在植物营养期和生殖期顶端、花瓣、柱头和 雄蕊中有很高的表达，其次是茎、叶和萼片。进一步用原位杂交实验调查WFL1 不同组织和不同发育时期的表达，结果显示在叶原基发育过程中的外层细胞表达 较强；花原基早期发育阶段各轮器官，如萼片，花瓣，柱头，雄蕊都有表达，在 花药发育成熟后期表达下调，而在花瓣，柱头及胚珠发育过程中持续高表达。通 过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析叶片脂肪酸成分和含量，结果显示wfl1 突 变体叶片脂肪酸含量显着低于野生型；脂肪酸成分发生剧烈变化，超长链脂肪酸 比例显着增加，亚麻酸比例显着减少，不饱和度降低。结果说明WFL1 基因功能 缺失引起蒺藜苜蓿超长链脂肪酸代谢紊乱。 关键词：花发育，背腹极性，TCP 基因，KCS 基因，蒺藜苜蓿 |
| 公开日期 | 2017-02-27 |
| 源URL | [http://ir.xtbg.org.cn/handle/353005/10293]  |
| 专题 | 西双版纳热带植物园_西双版纳热带植物园毕业生学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 阳天泉. 蒺藜苜蓿花发育基因TCP 和WFL1 的功能分析[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2016. |
入库方式： OAI收割
来源：西双版纳热带植物园
浏览0
下载0
收藏0
其他版本
除非特别说明，本系统中所有内容都受版权保护，并保留所有权利。