一种电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法，包括S1：测量薄膜两端的IV曲线，通过Labview程序线性拟合获得薄膜两端的电阻值；S2：通过圆柱模型的纳米孔电导率公式，薄膜两端的电导率可估算出小孔的孔径，进而实时输出；S3：对比测量小孔孔径与目标孔径的关系，决定下一步脉冲电压的强度V_output；本发明具有成本低、系统操作简单、操作全自动、纳米孔大小可调节、尺寸控制精度高等特点，可制备2.5nm以上任意尺寸的纳米孔，尺寸精度可控制在±0.5nm以内；在下一代DNA测序仪器开发，单分子检测以及癌症等医学检测领域具有非常好的应用前景。