PCR比色核酸探针在病原体检测中的应用
文献类型：学位论文
| 作者 | 杜凤 |
| 答辩日期 | 2014-05 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 导师 | 唐卓 |
| 关键词 | 病原体检测 Dnazyme G-四链体 Pcr 嗜水气单胞菌 Hiv Srbsdv 链置换扩增 Taqm1 |
| 学位专业 | 药物化学 |
| 英文摘要 | 近年来各种新型病毒和耐药性致病菌的不断产生使得人类构筑的抗生素防线持续后撤。人类必须对这些致病菌和病毒从发生到传播进行严密的监控，在细菌和病毒爆发前及时发现并切断其传播途径才能够将危害控制到最低的范围。因此，准确、快速、灵敏的病原体检测方法在这类疾病预防和治疗中就显得格外重要。目前，基于聚合酶链式反应（PCR）的核酸探针技术利用核苷酸碱基互补的原理，用特异的基因探针与被测定的靶序列互补以检测被测靶序列，在病原体检测中应用得最为广泛。其中TaqMan探针、分子信标、FRET探针以其灵敏性高和特异性强的突出优点，成为核酸探针的主要代表。但这些探针必须要经过荧光基团的化学修饰，合成成本相对高昂，且检测仪器较为高端，因此普适性不强。G-四链体（G-quadruplex）是一段富含鸟嘌呤的单链脱氧核酶（DNAzyme，Catalytic DNA，Deoxyribozyme）。这种DNAzyme与血红素（hemin）结合后，具有类似于过氧化物酶的活性，能催化H2O2将无色底物氧化成有色物质，因此近年来G-四链体被广泛用来作为核酸检测的信号报告分子。本论文旨在针对目前已有的病原体核酸检测技术的缺点和局限性，开发新的PCR比色探针检测体系。本论文希望建立多种以DNAzyme为信号报告分子、在使用成本和仪器需求上超越现有的荧光探针技术的、高特异的、高灵敏的PCR比色核酸探针检测体系，并将其应用到病原体的检测中。本论文分四个章节：第一章为文献综述。首先介绍了病原体检测的意义以及国内外进展，其次介绍了核酸探针和DNAzyme的种类和特点，并对DNAzyme目前在病原体检测中的应用情况进行了总结和归纳，最后进一步阐述了本论文所选课题的目的意义和创新点。第二章主要介绍了一种利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性释放DNAzyme的PCR比色核酸探针检测方法。本章详细阐述了该探针检测的原理，并通过试验证明了该检测方法的可行性及其在病原体嗜水气单胞菌检测中的应用。该检测方法具有成本廉价、仪器平台低、普适性强、比色检测简单方便、灵敏性高、特异性强等优势。第三章主要介绍了一种基于一步逆转录PCR和链置换扩增反应的RNA检测方法。该方法中应用了一种既具有Taq DNA聚合酶活性，又具有逆转录RT-PCR酶活性的突变DNA聚合酶-TaqM1。本章分别从该探针检测的原理、可行性验证及其检测方法的优化等方面进行了阐述和试验。此方法成功的应用到了血液样品中的病原体人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）RNA检测中，并得到了6 fM 到 60 pM的线性浓度范围。第四章主要介绍了一种基于复合PCR和lambda外切酶的核酸检测方法。该方法可以检测病原体DNA或RNA，根据需要选择普通Taq DNA 聚合酶或TaqM1 DNA聚合酶即可。本章以病原体南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）RNA为目标检测RNA，通过试验证明了该方法能成功应用到SRBSDV RNA的检测中。 |
| 学科主题 | 天然产物研究 |
| 语种 | 中文 |
| 产权排序 | 1 |
| 源URL | [http://210.75.237.14/handle/351003/28789]  |
| 专题 | 成都生物研究所_天然产物研究 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 杜凤. PCR比色核酸探针在病原体检测中的应用[D]. 中国科学院大学. 2014. |
入库方式： OAI收割
来源：成都生物研究所
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