喜树悬浮细胞、内生菌LY214及CaSLS异源表达体系中的天然产物研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 杨云 |
| 答辩日期 | 2017-05 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 导师 | 张国林 ; 罗应刚 |
| 关键词 | 喜树碱 N1-乙酰犬尿酰胺 悬浮细胞 裂环马钱子苷合成酶 酿酒酵母wat11 多粘类芽孢杆菌ly214 |
| 学位专业 | 药物化学 |
| 英文摘要 | 喜树碱（Camptothecin，CAM）及其衍生物为诸多肿瘤的治疗药物。CAM主要是从植物提取，喜树（Camptotheca acuminata）是CAM的主要来源植物之一，但植物生长缓慢、代谢产物含量低且其积累缓慢等因素制约了CAM的大量供给。从获取CAM的目的出发，我们建立了喜树细胞悬浮培养体系，研究了影响CAM产量的因素，发现了提高喜树悬浮细胞CAM产量的方法；对产CAM的喜树内生细菌多粘类芽孢杆菌LY214（Paenibacillus polymyxaLY214）的代谢产物进行了研究，为该菌的利用提供线索；对CAM生物合成关键酶—裂环马钱子苷合成酶（CaSLS）的进行了分子克隆和体外功能表征，在大肠杆菌表达系统中发现了选择性O-乙酰化产物。首先，利用喜树种子培养无菌幼苗，以该幼苗为外植体诱导产生愈伤组织，进而建立了喜树细胞悬浮培养体系。通过培养、发酵，我们发现大部分CAM存在于喜树悬浮细胞的培养液中；在无菌条件下继代培养喜树悬浮细胞，其CAM的产量逐渐降低。为此我们发展了低温保存和复苏培养方法以保存喜树悬浮细胞。通过向喜树悬浮细胞培养液中添加诱导因子，我们发现在部分诱导因子的作用下，CAM的产量得以恢复和提高。山梨糖醇表现出最强的诱导作用，与同代对照组相比，CAM产量能提高～500倍。添加CAM生物合成前体—色胺和马钱子苷到喜树悬浮细胞培养液中，CAM的产量无明显提高。但在添加色胺的喜树悬浮细胞培养液中，分离并鉴定了N1-乙酰犬尿胺（NKA）。色胺转化为NKA的发现为阐明喜树碱生物合成途径中吡咯并喹啉结构单元的形成提供了参考。通过培养、发酵喜树内生菌多粘芽孢杆菌LY214，我们获得了LY214代谢产物粗提物。采用薄层色谱、柱层析、HPLC等分离、纯化手段，我们从LY214发酵产物中分离得到27个化合物，主要为环二肽、氨基酸衍生物、芳香族化合物及衍生物、环肽等。通过质谱，核磁共振1-D、2-D谱，化学水解、Marfey’s衍生等方法，我们已鉴定2个新小分子化合物、1个新环九肽；尚有9个由7～9个氨基酸组成的环肽类化合物的确切结构在鉴定中。通过比较、分析现有转录组数据，我们克隆得到4个注释为CaSLS的获选基因。利用大肠杆菌表达系统对CaSLS进行异源表达、酶活测试等，结果表明CaSLS催化马钱子苷（loganin）转化为裂环马钱子苷（secologanin）的活性较弱。我们发现大肠杆菌能将马钱子苷和马钱子苷酸分别转化为6￠-O-乙酰化马钱子苷和6￠-O-乙酰化马钱子苷酸。利用 lRed重组系统成功敲除大肠杆菌JM109（DE3）基因组中乳糖乙酰转移酶基因（MAT），得到大肠杆菌JM109 △MAT（DE3）表达菌株。利用该菌株对候选CaSLS进行蛋白酶活测试，发现底物的O-乙酰化基本消失，但没有检测到CaSLS的催化活性。基于上述结果，我们准备在酵母系统中表达CaSLS，进而表征其功能。目前已经构建了适合在酵母中的表达载体，正在酿酒酵母WAT11（Saccharomyces cerevisiae WAT11）中进行表达及活性测试。 |
| 学科主题 | 天然产物研究 |
| 语种 | 中文 |
| 产权排序 | 1 |
| 源URL | [http://210.75.237.14/handle/351003/28817]  |
| 专题 | 成都生物研究所_天然产物研究 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 杨云. 喜树悬浮细胞、内生菌LY214及CaSLS异源表达体系中的天然产物研究[D]. 中国科学院大学. 2017. |
入库方式： OAI收割
来源：成都生物研究所
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