基于Gap-LCR和DNAzyme建立SNP的检测方法
文献类型：学位论文
| 作者 | 周丽 |
| 答辩日期 | 2013-05 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 导师 | 唐卓 |
| 关键词 | 脱氧核酶 G-四聚体 连接酶链式反应 Gjb235 Delc 单核苷酸多态性 |
| 学位专业 | 药物化学 |
| 英文摘要 | 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指基因组DNA中某一特定位置上的核苷酸发生转换、颠换、插入或缺失等变化引起的DNA序列多态性的现象,且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上，与许多疾病直接相关，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素，SNP检测在新药研究、个体化用药、临床检验和分子诊断等领域内具有巨大的产业价值。随着SNP研究的广泛，已经发展出各式各样的SNP的检测方法，常见的有以DNA构象、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、内切酶酶切、滚环复制、DNA测序、质谱等技术为基础的SNP检测方法。目前这些方法仍存在操作步骤复杂或费用昂贵等不足之处，如何改进现有技术、探索新途径，建立费用低、通量更高、结果可靠、操作方便的新型检测技术是目前迫切需要解决的问题。连接酶链式反应（ligase chain reaction, LCR）是一种基于寡核苷酸连接反应的核酸扩增技术，该技术操作简单、灵敏好、选择性高。缺口-连接酶链式反应（Gap-ligase chain reaction, Gap-LCR）是一种改进的LCR技术，可以进一步提高检测反应的特异性。本文基于脱氧核酶 (DNAzyme) 和Gap-LCR 建立了一种新型的SNP检测技术，该技术首先根据待检测基因的突变位点设计检测探针，通过Gap-LCR指数扩增待检测序列，通过检测可见光和荧光，形成两种报告体系，最终建立了一种灵敏度高、专一性好、快捷、廉价的SNP检测方法。将该方法运用于耳聋基因GJB2 235delC位点的检测，通过提取正常、杂合子、纯合子基因携带者的血液中的DNA，使用两组探针分别对其进行检测，检测结果与预测的一致，证明该方法适合推广到疾病诊断领域。具体说来，这一检测方法的主要特点表现在以下几个方面：1） 在探针中引入DNAzyme。DNAzyme是一种富含鸟嘌呤、能够产生信号、具有类似于过氧化物酶催化功能的DNA序列，与卟啉铁（Hemin）或者卟啉铁类似物结合后，具有类似于过氧化物酶的活性，能催化H202将显色底物（ABTS，盐酸酪胺等）氧化成有色或者有荧光的物质，可以直接在室温下通过观察颜色或者荧光强度的变化来检测核酸。2） 在扩增反应中采用 Gap-LCR技术。Gap-LCR是一种修饰过的LCR技术，在LCR体系中，在分别互补配对的两组探针的连接处设计一个碱基的缺口，使该缺口处的碱基必须通过DNA聚合酶进行延伸后，才能在连接酶的作用下进行连接反应，最终实现核酸的指数扩增。Gap-LCR技术能够避免探针自身引起的平末端的连接反应，从而降低背景，增加灵敏度。3) 该方法具有很高的灵敏度和专一性。以检测镰刀形基因为例，该检测方法的检测线达到103拷贝，专一性高达1:105，即能从105拷贝的干扰分子中检测到1个目标分子。4) 该检测方法具有多种检测方案，向Gap-LCR扩增反应中的一个磷酸化探针3端引入DNAzyme序列，利用DNAzyme序列的特殊性质和两种外切酶（Lambda exonuclease 和Exonuclease III），可以实现比色、化学发光或荧光信号的检测，因此可以建立多种报告体系。5） 该检测方案具有普适性和实用性，可以根据不同的被检测目标基因设计不同的检测探针用于不同突变位点的检测，可以用于多种可遗传性疾病的检测与诊断。 综上所述，本文在国际上首次利用脱氧核酶 (DNAzyme) 和缺口-连接酶链式反应 (Gap-LCR)，实现了一种灵敏度高、专一性好、快捷、廉价的单核苷酸多态性（SNP）的检测方法。 |
| 学科主题 | 天然产物研究 |
| 语种 | 中文 |
| 产权排序 | 1 |
| 源URL | [http://210.75.237.14/handle/351003/28822]  |
| 专题 | 成都生物研究所_天然产物研究 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 周丽. 基于Gap-LCR和DNAzyme建立SNP的检测方法[D]. 中国科学院大学. 2013. |
入库方式： OAI收割
来源：成都生物研究所
浏览0
下载0
收藏0
其他版本
除非特别说明，本系统中所有内容都受版权保护，并保留所有权利。