腔肠素酶改造及功能扩展研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 付志聪 |
| 答辩日期 | 2016-05 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 导师 | 唐卓 |
| 关键词 | 腔肠素酶 随机筛选 融合蛋白 移码 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 英文摘要 | 近年来，一种新型的生物发光蛋白——Gaussia Luciferase（GLuc）吸引了很多研究者的注意。该蛋白来自一种生长在中深海的桡足类动物——长腹水蚤。经过分子生物学的分析，发现GLuc是目前已发现的最小的生物发光蛋白，只有185个氨基酸，蛋白分子量不到20KDa.而且该蛋白催化生物发光只需要底物腔肠素和氧气的参与，不需要其他辅助因子，从而大大扩大了其应用范围。但是GLuc这种荧光素酶只能催化一种底物——腔肠素，而且发出的光属于波长在480nm左右的蓝绿光，该波长也限制了其在体内作为示踪定位等功能的应用。本课题主要研究的内容为，第一：使用不同的方法对GLuc进行突变，使其对一种腔肠素的衍生物产生生物学活性并催化其产生红光。或者对原来特异性的底物腔肠素，增强其反应功效，使其在发光强度、发光半衰期、发光波长迁移这三个指标方面由于野生型GLuc；第二：构建一种过氧化物酶/GLuc融合蛋白，使其可以在无氧或缺氧的环境下，能够通过引入过氧化物提供额外氧气产生或增强生物发光反应。本课题主要使用有性重组和易错PCR的方法在GLuc基因中引入随机突变，构建一个GLuc编码基因全随机突变库，之后将突变库中的基因和相应载体进行酶切，之后连接，转化至表达蛋白的大肠杆菌感受态细胞BL21中，扩大培养或进一步诱导，加入底物在酶标仪上筛选。融合蛋白主要采用全质粒PCR平末端连接的方法。使用酶标仪进行GLuc突变体筛选的方法尚属首次，该方法比常用的利用CCD相机进行筛选的通量要大，灵敏度要更高。另外，报导过的与GLuc相关的融合蛋白多是特异性比较强，用于靶标定位的抗原抗体物质。本课题利用融合蛋白中的过氧化物酶来增强反应中的活性也尚属先例。 另外在构建融合蛋白的过程中，发现了腔肠素酶基因插入和缺失移码的现象，并对这一现象进行了探索。 |
| 学科主题 | 天然产物研究 |
| 语种 | 中文 |
| 产权排序 | 1 |
| 源URL | [http://210.75.237.14/handle/351003/28844]  |
| 专题 | 成都生物研究所_天然产物研究 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 付志聪. 腔肠素酶改造及功能扩展研究[D]. 中国科学院大学. 2016. |
入库方式： OAI收割
来源：成都生物研究所
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