大肠杆菌中3-羟基丙酸抗性机制及其衍生物丙烯酸的生物合成研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 童文华 |
| 答辩日期 | 2016-05 |
| 文献子类 | 博士 ; 学位论文 ; 博士 ; 学位论文 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 赵广 |
| 关键词 | 大肠杆菌 3-羟基丙酸 酸抗性 不饱和脂肪酸 丙烯酸 |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物化学 |
| 英文摘要 | 3-羟基丙酸（3-HP）是一种重要的平台化合物，拥有成熟的生物合成方法，但是其工业化应用方面存在两个主要问题：1，3-HP对细胞有毒性抑制，影响细胞生长，增加生产成本；2，部分3-HP衍生物人工代谢途径缺失。本文针对这两个问题，研究大肠杆菌对3-HP的应激过程，筛选到一批应激基因，发现一种新的酸抗性机制，并通过代谢工程改造大肠杆菌合成了3-HP的重要衍生物—丙烯酸。 为了解大肠杆菌的3-HP抗性机制，该研究在3 g/L 亚致死浓度3-HP存在时，利用单基因缺失文库keio collection （NBRP，日本）监测每个突变株在3-HP胁迫时的生长状况。使用基本培养基培养并测定突变株文库的生长曲线，结果显示3-HP胁迫时，有18个单基因缺失株耐受性增强，有20个单基因缺失菌株对3-HP更敏感。在此基础上将筛选得到的菌株在对数中期OD600nm~0.6时加入5 g/L 3-HP胁迫，测定以上菌株在对数中期是否有同样的效应。存活率结果显示，4个单基因缺失菌株依然表现出耐受性增强的性状，7个单基因缺失菌株表现为对酸很敏感。 本研究发现3-HP刺激后，大肠杆菌细胞膜磷脂中不饱和脂肪酸组分增多，利用其他有机酸和无机酸刺激后确认这种变化是由3-HP的酸毒性所导致，根据此结果本研究对酸刺激与不饱和脂肪酸合成之间的关系进行研究。存活率测定显示，酸刺激时不饱和脂肪酸合成关键基因fabA、fabB对细胞的酸耐受性至关重要，通过生物学信息预测，在fabA、fabB的启动子区发现了CpxR保守结合位点的类似序列。通过对fabA和fabB在转录和蛋白水平表达量的分析，结合存活率实验，最终证明二组分系统CpxRA可以上调fabA、fabB的转录和蛋白表达水平, 进而导致大肠杆菌细胞膜磷脂中不饱和脂肪酸含量升高，增强细胞对酸胁迫的耐受性。实验结果表明我们在大肠杆菌中发现了一种新的酸抗性机制，本发现将会进一步完善大肠杆菌酸抗性体系，对有机酸的生物合成及部分细菌的病理学研究有重要意义。 在3-HP的衍生物中，丙烯酸作为重要的有机合成原料及合成单体，其人工合成路径缺失。从分子结构来看，3-HP与乳酸是同分异构体，都可以直接脱水形成丙烯酸，但是由于C3结构稳定性强，不易直接在碳链骨架上进行氧化还原等反应，故而需要在其末端加上CoA基团，活化C3结构，使相关反应更易进行。该研究首次设计了一条依赖辅酶A的新路径，以甘油为底物和碳源，经由3-羟基丙醛，3-羟基丙酰辅酶A，丙烯酰辅酶A，最终在大肠杆菌中直接发酵得到丙烯酸。新路径的限速酶是3-羟基丙酰辅酶A脱水酶，其属于烯酰辅酶A水合酶家族，通过序列比对及文献调研，共找到4个候选的烯酰辅酶A水合酶：PhaJ1, EcH, HcaD, PcsII。将这4个烯酰辅酶A水合酶分别引入新的代谢路径，检测更适合本途径丙烯酸合成的酶，结果发现PcsII更适合在本研究中作为3-羟基丙酰辅酶A脱水酶生产丙烯酸。引入PcsII之后，新的路径能够代谢产生丙烯酸，但发酵产量很低，为了提高产物量，本研究将双质粒中的部分基因整合到工程菌株染色体上，携带单质粒的工程菌摇瓶发酵得到6.92 mg/L产物。本研究还对PcsII进行改造以提升丙烯酸产量，通过与烯酰辅酶A水合酶家族有报道的蛋白质结构信息比对，发现两个对于烯酰辅酶A水合酶家族保守的氨基酸残基：Lys和Ala，利用定点突变技术将PcsII 103位的Arg和186位的Asp分别回复突变为Lys和 Ala。突变后发现产物量有较大提升，将两个突变位点整合在PcsII上形成双突变PcsIIR103K-D186A，最终使摇瓶中丙烯酸的产物量达到37.7 mg/L。 |
| 学科主题 | 理学 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2020-06-30 |
| 源URL | [http://ir.qibebt.ac.cn/handle/337004/9759]  |
| 专题 | 青岛生物能源与过程研究所_材料生物技术研究中心 |
| 作者单位 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 童文华. 大肠杆菌中3-羟基丙酸抗性机制及其衍生物丙烯酸的生物合成研究[D]. 北京. 中国科学院大学. 2016. |
入库方式： OAI收割
来源：青岛生物能源与过程研究所
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