低Mg2+诱导的大肠杆菌裂解系统的构建
文献类型：学位论文
| 作者 | 姚岚 |
| 答辩日期 | 2016-05 |
| 文献子类 | 硕士 ; 学位论文 ; 硕士 ; 学位论文 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 赵广 ; 刘辉 |
| 关键词 | 大肠杆菌 Λ噬菌体裂解基因 Mg2++ 聚-3羟基丙酸 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 其他题名 | 无 |
| 英文摘要 | 微生物代谢产物可以分为胞外产物和胞内产物两类。与胞外产物相比，胞内产物的分离首先要通过物理或化学手段进行细胞破碎，使代谢产物释放。目前常用的细胞破碎方法存在着能耗高、污染大等弊端，因此我们希望构建一个自诱导裂解系统，使细胞在发酵后期裂解并释放产物。 大肠杆菌λ噬菌体裂解基因（SRRZ）编码三个蛋白，其中基因S编码穿孔素（holin），攻击内膜蛋白；基因R编码裂解素（endolysin），使细胞壁水解；基因RZ编码辅助裂解因子。将裂解基因连接到质粒pBAD18上表达，构建了重组菌株Q2537。在Q2537培养过程加入阿拉伯糖诱导后，菌体迅速裂解，证明了裂解基因的有效性。考虑到实际生产过程，我们希望建立一种更为经济、简单的裂解系统。 基因mgtA的转录受到二组分系统PhoPQ和其mRNA 5’非翻译区（5’UTR）内核糖开关的共同控制。Mg2+浓度较低的条件会激活受PhoP调节基因mgtA的表达；在Mg2+浓度较高的条件下，基因mgtA的表达受到抑制。mgtA核糖开关可作为细胞内Mg2+浓度传感器，并根据Mg2+浓度形成不同的高级结构，当细胞内Mg2+浓度升高时，核糖开关的特定结构会在转录进行到编码区之前将其提前终止。 在本研究中，我们克隆了λ噬菌体裂解基因SRRZ，对裂解基因的裂解效果进行了验证，发现在1小时内，菌株即表现出明显的裂解效果；然后在裂解基因前插入基因mgtA的启动子PmgtA. 重组质粒在不同宿主中均表现出明显的裂解效果，裂解效率在90%以上，但是在聚3-羟基丙酸（P3HP）的发酵过程中发现，质粒丢失现象严重，产物释放率较低。因此，我们将片段PmgtA-SRRZ克隆到P3HP生产菌株Q1638携带的质粒pW01中，使双质粒系统转变为单质粒系统，质粒稳定性提高2.7倍，同时在聚3-羟基丙酸（P3HP）的发酵过程中，P3HP的产量占细胞干重的70 %以上，比原始菌株提高了2.37倍，单质粒裂解系统产物释放率大幅提高；为进一步提高基因的稳定性，同时减少抗生素的使用，降低生产成本，我们利用染色体整合（Chromosome Gene Integration，CGI）手段，将裂解系统的基因片段整合到基因组染色体上进行表达，但是CGI裂解效果较差，将启动子更换为PT7或Plac后，短时间内仍无明显的裂解效果。 随着现代生物技术手段的不断发展，微生物法合成生物化工产品得到了迅速地发展。经济方便的产品分离提纯过程，对微生物发酵的发展十分重要。我们建立的肠杆菌自诱导裂解系统，可以通过微生物代谢过程中对Mg2+的消耗，在发酵后期自行裂解并释放产物，操作方便；裂解基因的表达不需要使用昂贵的诱导剂，经济性高；同时，裂解系统的裂解效率高，产物释放率高。Mg2+诱导的大肠杆菌自诱导裂解系统除用于P3HP的产物回收外，还可用于其他胞内产物如蛋白质等的分离，为微生物代谢产物的分离提供了新思路，对微生物发酵产业的发展意义深远。 |
| 学科主题 | 工业催化 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2019 |
| 源URL | [http://ir.qibebt.ac.cn/handle/337004/9773]  |
| 专题 | 青岛生物能源与过程研究所_材料生物技术研究中心 |
| 作者单位 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 姚岚. 低Mg2+诱导的大肠杆菌裂解系统的构建[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2016. |
入库方式： OAI收割
来源：青岛生物能源与过程研究所
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