雨生红球藻原生质体制备及细胞融合研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 徐晓莹 |
| 答辩日期 | 2015-06 |
| 文献子类 | 硕士 ; 硕士学位论文 ; 硕士 ; 硕士学位论文 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 刘天中 |
| 关键词 | 雨生红球藻 原生质体制备 繁殖方式 小球藻 细胞融合 |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 其他题名 | 无 |
| 英文摘要 | 雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，但其生长缓慢，培养条件要求高，细胞无法进行高密度培养，这些都限制了雨生红球藻的规模培养效率。而单细胞绿藻小球藻（Chlorella）环境耐受性强、繁殖快、人工培养较易，而且能够利用葡萄糖等多种底物进行高密度异养发酵。因此，如果能够通过它们之间的细胞融合杂交过程繁育雨生红球藻新品种，使其既能进行高效糖异养，又能高效积累虾青素，则有可能大大提高雨生红球藻的虾青素生产效率。因此本文以实现小球藻和雨生红球藻的细胞融合与糖异养突变株筛选为目标，建立了雨生红球藻原生质体制备技术，分析了雨生红球藻细胞分化的影响以及调控因素，实现了雨生红球藻与小球藻间原生质体的杂交融合与筛选，并对获得的融合子进行了表型鉴定与分析。 首先，通过雨生红球藻的原生质体制备研究发现，雨生红球藻生活史中的游动细胞与不动细胞分化对原生质体的制备过程有明显的影响，因此需要针对性采取不同的酶处理条件。相对于雨生红球藻不动细胞，游动细胞缺少纤维素化的细胞壁结构，原生质体仅由胞外基质（ECM）所包被，这使得游动细胞本身就对外界的低渗透压环境反应敏感。由于细胞在低渗透压下的爆破特点是原生质体制备效率的关键指标，因而培养中高游动细胞比例经常会被误认为获得了高的原生质体制备效率。为此，本研究分别利用富集化培养获得的雨生红球藻游动细胞和不动细胞，对比了不同酶处理过程的影响，建立了相关的原生质体制备与处理技术。结果表明，雨生红球藻游动细胞经过蛋白酶处理后，ECM层被去除，得到完全裸露的原生质体，其中以0.4%的胶原蛋白酶IV效果最佳，在35℃下酶解45 min后，ECM去除率为74.43%，细胞存活率为69.16%；不动细胞的原生质体制备中，以蛋白酶K和纤维素酶+蜗牛酶的组合效果最佳，酶处理后渗透压敏感细胞的得率可以提高到40%左右，但是显微观察证明，虽然不动细胞的细胞壁纤维素层得到有效降解，但是其二级细胞壁结构仍然大部分保持完整，这限制了其原生质体制备效率的进一步提高。 其次，本文基于游动细胞和不动细胞间Triton X-100敏感性差异指标，建立了一种快速监测培养过程中细胞分化的方法，并利用该方法对雨生红球藻在五种培养基BG11、BG11+ACE、BG11 +YE、BG11+ACE +YE和BBM中的生长与细胞分化差异进行了比较分析。发现雨生红球藻在五种培养基中培养的前2天出现的细胞数快速增殖主要是不动细胞形成孢子囊，再释放出游动孢子的繁殖模式。但在培养2天以后，BG11和BG11+ACE培养基中大部分游动孢子都成熟并转变成不动细胞；而BBM、BG11 +YE和BG11+ACE+YE培养基中游动细胞在后续的几天培养中仍维持较高比例。这种细胞分化差异主要是由于BBM、BG11 +YE和BG11+ACE+YE培养基中游动细胞通过有丝分裂或形成游动孢子囊两种模式维持了其继续分裂与增殖的能力；而BG11和BG11+ACE培养基中这些繁殖形式缺失的主要原因在于其较低的磷浓度。因此培养基中适当高的磷含量对于保持雨生红球藻培养中期游动细胞的持续繁殖非常关键。 最后，通过PEG介导的方法进行了雨生红球藻与小球藻原生质体的融合杂交，并且通过选择性的筛选条件，获得了能够进行糖异养生长的雨生红球藻与小球藻融合子（Hp-CK）克隆。通过初步鉴定结果发现部分融合子在持续分裂后存在遗传不稳定的特点，从而导致所获杂交表型的减弱和丧失，但是该结果表明通过雨生红球藻与小球藻的原生质体杂交有可能获得具有利用葡萄糖生产的雨生红球藻异养表型株，而且如果能对原生质体融合株进行进一步的诱变或其他手段介导，实现基因组DNA间的稳定杂交遗传，将有可能进一步提高异养表型株的育种效率。 |
| 学科主题 | 工学 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2018-09 |
| 源URL | [http://ir.qibebt.ac.cn/handle/337004/9783]  |
| 专题 | 青岛生物能源与过程研究所_微藻生物技术团队 |
| 作者单位 | 1.青岛生物能源与过程研究所 2.中国科学院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 徐晓莹. 雨生红球藻原生质体制备及细胞融合研究[D]. 北京. 中国科学院大学. 2015. |
入库方式： OAI收割
来源：青岛生物能源与过程研究所
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