miRNA RT-PCR引物设计优化及miR-192功能研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 冯世鹏 |
| 答辩日期 | 2009-06-05 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 张必良 |
| 关键词 | Stem loop RT-PCR miR-192 细胞增殖 RB1蛋白 肺癌 |
| 学位名称 | 博士 |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 其他题名 | miRNA RT-PCR primer design and miR-192 function analysis |
| 英文摘要 | microRNA（简写miRNA）是目前研究最热门的非编码小RNA之一，它是一类长度约为22bp，由dicer酶从有特定二级结构的前体剪切加工成熟的，通过与靶mRNA 3’UTR完全或不完全配对来调节基因的表达的单链RNA分子，它属于非编码小RNA家族的一员，在物种之间有很高的保守性，目前发现的人类miRNA为706个，其在体内的功能有待进一步的研究。 本文通过对已发表的miRNA两种定量研究方法嵌套发卡结构（ nested stem loop）及发卡结构（stem loop ）RT-PCR进行比较发现，虽然这两种方法均可达到较好的定量效果，但是嵌套发卡结构的RT-PCR方法在检测灵敏度及特异性方面均优于发卡结构的RT-PCR方法。改变嵌套发卡结构的引物序列和结构以及PCR反应条件，并以检测灵敏度及特异性作为指标对miRNA定量PCR方法做了进一步探索。去掉反转录引物嵌套茎会引起非特异扩增，缩小嵌套环使检测灵敏度降低；增加或者缩短反转录引物的嵌套茎的长度对特异性无明显影响；延长反转录引物与miRNA配对部分的长度（overlap）使检测灵敏度提高，但是特异性降低，LNA修饰overlap可增加检测灵敏度，对检测特异性无明显影响。对PCR条件优化发现：升高退火温度可增加miRNA检测特异性而降低灵敏度；增加引物浓度均会有限提高miRNA检测灵敏度；反转录引物混合会增加引物间的相互影响，可用低浓度的反转录引物混合进行多miRNA检测。 对miR-192功能研究发现：三种实验方法（MTT法、Celltiter法、EdU法）均证实miR-192抑制A549细胞增殖；对miR-192进行靶点预测及验证发现miR-192通过所预测的靶点作用于RB1 3‘UTR报告基因，对RB1蛋白的调控是在转录后水平调控，同时下调RB1蛋白的mRNA及蛋白水平；siRNA干扰RB1蛋白的表达降低了A549细胞活性。BALB/c小鼠体内试验进一步证实miR-192显著抑制肿瘤的生长。 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 93 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/914]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 冯世鹏. miRNA RT-PCR引物设计优化及miR-192功能研究[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2009. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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