Part 1. “Click Chemistry”在siRNA分子链接修饰中的应用 RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默机制，可以由长度为21~25个核苷酸序列的双链小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)引发，以高度的序列特异性高效降解靶mRNA。因此，化学合成的siRNAs被看做是一种全新的对传染性疾病，基因病变，及癌症的核酸疗法。尽管siRNA在生物医疗领域具有巨大的应用潜力，但是要想实现临床应用，还需巧妙设计针对siRNA的递送系统以增强siRNA肌体给药后的稳定性，赋予siRNA针对目标器官组织的靶向性，提高靶细胞对siRNA的吸收效率。为了将siRNA有效地递送到靶细胞和组织内，许多不同的siRNA生物链接分子被合成出来，它们的生物化学性质被系统表征，它们的基因沉默效率分别在细胞和活体水平上被测试。 在此，我们开发了一种基于Cu催化的叠氮-炔基环加成反应或称“click reaction”的针对RNA-ligand链接分子的有效化学合成方法。我们选择了siRNA链的三处位点，并测试了在这三处位点通过“click reaction”对siRNA进行分子链接修饰的可行性和适用性：带有丁炔基活性基团的亚磷酰胺单体用于对siRNA链的5’-末端进行分子链接修饰；带有丙炔基活性基团的亚磷酰胺单体用于对siRNA链的3’-末端进行分子链接修饰；带有5-乙炔基活性基团的尿苷分子用于对siRNA链的中间位置进行分子链接修饰。我们还合成了带有叠氮功能基的亲脂性长链烷烃分子，生物活性分子胆固醇叠氮衍生物(Chol-N3)，以及花菁素荧光染料叠氮衍生物(Cy3-N3)，并利用这些含叠氮基团的功能性分子研究了在溶液中通过“click reaction”对炔基化的RNA分子进行分子链接修饰的物理化学特性。 Part 2. 2'-O-DMNA保护基在RNA固相合成中的应用 由于化学合成的小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)双链可以特异性地抑制内源或外源基因在哺乳动物细胞内的表达，因此来自于基因治疗领域对化学合成的寡核苷酸序列的需求越来越大，伴随着需求的增长，RNA的固相合成方法也在不断地被改进。由于核苷2’-OH的保护基限制了RNA固相合成的偶合动力学研究及偶合效率的提高，并且决定了用于保护其它剩余活性基团保护基的性质，因此设计和选择2’-OH保护基成为最近几十年来对RNA固相合成法改进的研究重心。 在本论文中，我们开发了一种新颖的用于RNA固相合成的2’-OH保护基——2’-O-{[2,2-二甲基-2-(2-硝基苯基)]乙酰氧基}甲基(2’-O-DMNA)。由于两个甲基及一个邻硝基苯基的巨大空间位阻，使得2’-O-DMNA保护基与酸不稳定的核苷糖环5’-OH保护基(例如，5’-O-DMTr)，以及碱不稳定的核苷碱基N-酰基保护基和磷酸骨架的2-氰乙基保护基完全兼容。 我们用2’-O-DMNA保护的尿苷亚磷酰胺单体合成了长度为20个核苷酸的全U序列RNA链——U20，并用此合成的RNA链测试、优化了对2’-O-DMNA的脱保护基条件。对DMTr自由基的光谱监测数据显示，使用2’-O-DMNA保护基的亚磷酰胺单体可比使用商业化的2’-O-TBDMS保护基的亚磷酰胺单体在固相合成时获得更高的偶合效率。HPLC监测结果显示在NH4Cl浓度为50 µM~5 mM的水溶液中，使用铁粉为还原剂，反应温度为55 ℃，经过2.5~3 h，可将RNA链的2’-O-DMNA保护基完全脱除。高的偶合效率，低离子浓度的脱保护基溶液，完全无毒的脱保护基试剂，纯水相反应条件，上述这些优点使得2’-O-DMNA保护基成为一种具有巨大应用潜力的RNA固相合成中的2’-OH保护基。 Part 3. “Click Chemistry”在细胞DNA/RNA合成检测中的应用 在细胞中标记新合成的DNA是一种检测细胞增殖的重要实验技术手段。最精确的测定方法为将[3H]-胸苷或5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)代替天然核苷胸苷，在细胞周期的S期整合进入细胞新合成的DNA链中，随后通过放射性自显影技术或免疫组织化学法直接测定细胞新合成的DNA链。最近，一种利用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)测定增殖细胞中DNA合成的方法被开发出来。此种方法利用EdU代替天然胸苷整合进入细胞新合成的DNA链，随后通过“click chemistry”用一含有叠氮修饰基团的荧光分子进行检测。此种新方法不仅检测灵敏度高，而且不需对DNA进行变性。但其所用核苷酸类似物EdU对细胞增殖具有时间依赖性的抑制作用。在本论文中我们开发了一种新颖的脱氧胞苷类似物——5-乙炔基-2’-脱氧胞苷(EdC)，其可以在细胞和活体水平被用于DNA合成的检测，并且灵敏度与EdU相近。此外，当EdC与胸苷联合使用时，其引起的细胞毒性远小于EdU，这种特点使得其在对增殖细胞的长期检测中具有巨大的潜在应用价值。 对细胞RNA合成的检测是众多科学家进行细胞生物学研究的一项重要技术手段。最近，一种新的基于5-乙炔基尿苷(EU)分子的新方法被开发出来用于检测细胞中RNA的合成。此方法的原理为利用EU替代天然尿苷分子通过生物合成整合进细胞新合成的RNA序列中，随后用一含有叠氮修饰基团的荧光染料分子通过“click chemistry”对其进行检测。这种新技术不仅操作简便而且灵敏度高。为了筛选合适的可通过“click chemistry”对细胞新合成的RNA链进行标记的核苷酸分子衍生物，我们合成了一系列含有炔基官能团的核苷酸分子衍生物。通过筛选我们发现，如同EU分子，5-乙炔基胞苷(EC)可以通过生物合成被有效整合进细胞新合成的RNA链中，而5-乙炔基-2’-脱氧-2’-氟尿苷则可以通过生物合成被有效整合进细胞新合成的DNA链中。炔基修饰的嘌呤类核苷衍生物分子则不适合用于对细胞RNA合成的标记。