I. 肝细胞核因子-4α在丙型肝炎病毒生活周期中的作用研究 II. 丙型肝炎病毒永生化树鼩肝细胞培养系统的构建初探
文献类型：学位论文
| 作者 | 李新磊 |
| 答辩日期 | 2013-10-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 彭涛 |
| 关键词 | I.肝细胞核因子-4α 丙型肝炎病毒 极低密度脂蛋白 分泌型磷脂酶A2GXIIB 病毒包装和释放 II.永生化基因 永生化树鼩肝细胞 细胞培养系统 microRNA-122 载脂蛋白 |
| 学位名称 | 理学博士 |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 其他题名 | I. Role of Hepatocyte Nuclear Factor-4α in the Life Cycle of Hepatitis C Virus II. Development of Immortalized Tupaia Hepatocyte Permissive for Hepatitis C Virus Infection |
| 英文摘要 | I. 肝细胞核因子-4α在丙型肝炎病毒生活周期中的作用研究摘要丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus , HCV) 引起的慢性传染性疾病。HCV的生活周期与宿主脂代谢密切相关。HCV病毒颗粒的包装和释放与极低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein, VLDL）通路密切相关。HCV颗粒包装进VLDL颗粒中，通过胞吐作用释放到胞外。肝细胞核因子-4α（hepatocyte nuclear factor-4α, HNF4α）属于核因子超家族成员，是表达量最高的肝细胞特异转录因子（liver-enriched transcription factor, LETF），在成熟肝细胞内HNF4α主要参与调控宿主的脂代谢，尤其是VLDL分泌通路。但是HNF4α是否参与了HCV的生活周期尚不清楚。本篇文章对HNF4α在HCV生活周期中的作用进行了研究。我们首先发现HCV复制可以上调HNF4α的表达。小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）介导的HNF4α敲低表达可抑制HCV的包装和释放。HNF4α的抑制剂苯扎贝特（bezafibrate）也可以显著抑制HCV的包装和释放。HNF4α过表达可以增加感染性HCV的产生。故我们证明了HNF4α是HCV病毒颗粒的包装和释放必需的胞内因子。我们进一步发现HNF4α的下游因子分泌型磷脂酶A2 GXIIB（PLA2GXIIB）在HCV生活周期中发挥作用。HCV感染可以上调PLA2GXIIB的表达，而HNF4α参与了这种上调。敲低PLA2GXIIB后HCV的释放过程受抑制，而过表达PLA2GXIIB可以增加HCV的分泌，PLA2GXIIB是HCV病毒释放必需的因子。进一步研究发现 HNF4α对HCV滴度的调节是通过下游的PLA2GXIIB和微粒体甘油三酯转运蛋白（microsomal triglyceride transfer protein, MTP）共同实现的。敲低HNF4α后胞内脂滴的数目降低，体积变大，这种细胞器结构的改变可能是HNF4α影响HCV病毒产生的机制之一。本研究发现HNF4α在HCV的病毒包装和释放过程中的重要作用，进一步证实了宿主VLDL通路与HCV生活周期的密切关系。我们的结果显示HNF4α可能是HCV挟持宿主VLDL代谢通路的关键调控因子。HNF4α和PLA2GXIIB等与宿主VLDL形成和释放相关的因子可以成为HCV治疗药物的候选靶点，为进一步优化抗HCV疗法提供借鉴。II. 丙型肝炎病毒永生化树鼩肝细胞培养系统的构建初探摘要自1989年发现HCV基因组以来，HCV研究的主要障碍在于缺乏合适的细胞培养系统以及小动物模型。敲除了天然免疫通路相关因子的小鼠中表达人源HCV受体基因可以支持HCV的感染、复制、病毒颗粒的释放。但由于天然免疫通路缺损，该小鼠并非真正意义上的免疫正常的小鼠。HCV不能在该小鼠中建立慢性感染。此外，HCV对该小鼠的感染效率非常低，感染后血清中HCV的滴度也非常低，这说明真正实用的HCV小鼠模型仍没有完全建立。树鼩(tupaia belangeris, Tree Shrew)分类上接近灵长目动物。研究表明我国特有的树鼩品种——中国树鼩（tupaia belangeri chinensis）可以支持HCV的感染：血清或细胞培养的HCV病毒感染树鼩可建立长期感染，并可检测到肝脏组织病变；树鼩原代肝细胞感染血清来源的或细胞培养来源的HCV病毒后可产生有感染力的病毒颗粒。树鼩由于是HCV的天然宿主，且免疫系统正常，所以是非常有潜力的HCV小动物模型。HCV对树鼩的感染效率比较低，但是可以体外筛选树鼩偏好的HCV毒株。而原代树鼩肝细胞在体外不能传代增殖限制了它的应用。我们将分离的树鼩原代肝细胞通过慢病毒载体介导的基因转移，将猿猴空泡病毒SV40大T抗原基因和hTERT基因转入细胞，经筛选得到了永生化树鼩肝细胞系(Immortalized Tupaia Hepatocytes, ITH)。我们对ITH细胞的形态、生长曲线、致瘤性、核型、肝细胞特异的分子标记等进行了研究，确证了ITH细胞的肝细胞属性。ITH细胞可以支持HCVpp感染，并且表达CD81、SR-BI、CLDN1、OCLN、LDLR、TfR1、NPC1L1等HCV受体。我们克隆得到了树鼩来源的CD81、SR-BI、CLDN1、OCLN，测序表明它们与人源的蛋白有很高的序列相似性。ITH细胞可以支持HCV RNA的翻译起始过程，但不能有效支持HCV RNA的复制。树鼩来源的ApoE分子支持HCV的包装和释放，发挥与人源的ApoE相当的功能。ITH细胞内miR-122分子的表达量很低，这可能限制了ITH细胞内HCV RNA的复制效率。我们目前没有成功构建ITH细胞来源的HCV培养系统，但我们的研究为成功完成这一目标奠定了基础。除此之外， ITH细胞可以支持HSV，HBV的感染，表明ITH也可以称为潜在的其他病毒的培养系统。 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 208 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1006]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李新磊. I. 肝细胞核因子-4α在丙型肝炎病毒生活周期中的作用研究 II. 丙型肝炎病毒永生化树鼩肝细胞培养系统的构建初探[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2013. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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