CRISPR/Cas9系统介导家兔多基因打靶的研究及IL2RG基因敲除兔的建立
文献类型：学位论文
| 作者 | 颜泉梅 |
| 答辩日期 | 2014-04-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 赖良学 |
| 关键词 | 家兔 CRISPR Cas9系统 多基因打靶 IL2RG基因 免疫缺陷动物 |
| 学位名称 | 博士 |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 其他题名 | Application of CRISPR/Cas9 system to multiple genes targeting in rabbits and the establishment of IL2RG gene knock-out rabbits |
| 英文摘要 | 兔子是一种重要的标准实验动物，被广泛应用于生物医药研究领域。基因修饰兔对于了解人类疾病发病机理，开发药物及新的治疗手段都具有重要的作用。由于在兔子上还没有建立具有生殖系嵌合能力的胚胎干细胞（ESc）或诱导多能干细胞（iPS），体细胞核移植技术（SCNT）体系也不成熟，在ZFN和TALEN技术出现以前，很难对兔子基因组进行定点修饰。 最近，CRISPR/Cas9系统作为一种比ZFN、TALEN更为简单、高效的基因打靶工具已经成功应用于如小鼠、大鼠、猪、兔子和猴子等哺乳动物的基因修饰研究。更受科学家们青睐的是CRISPR/Cas9系统在多基因打靶上具有独特的优势，利用CRISPR/Cas9系统已经在人的细胞、小鼠、大鼠和猴子上实现了一步多基因修饰，这对于建立由多基因导致的人类疾病动物模型提供了一种很有潜力的工具。但到目前为止，在兔子上无论是利用ZFN、TALEN系统或着是利用CRISPR/Cas9系统都还没有实现一步多基因打靶的报道，因此，在本研究中我们对通过CRISPR/Cas9系统结合原核期受精卵RNA胞质内显微注射来建立家兔多基因打靶技术体系的可行性进行了探索。 首先，我们对CRISPR/Cas9系统介导的家兔单基因打靶效率进行了研究。在该部分我们选择IL2RG和Tiki1，分别对这两个基因进行打靶。在新生兔仔中，IL2RG基因双等位基因敲除（双敲）效率为100%，单等位基因敲除（单敲）效率为100%；Tiki1基因双敲效率为60%，单敲效率为100%。接下来，我们选择IL2RG、RAG1和RAG2基因来检测CRISPR/Cas9系统在兔子上同时进行2个基因和3个基因打靶的效率。在新生兔仔中，2个基因同时双敲的效率为100%，三个基因同时双敲的效率为67.7%。最后，我们选择IL2RG、RAG1、RAG2、Tiki1和ALB基因来检测5个基因同时打靶的效率。我们只得到了1只同时注射5个基因的新生仔兔，该兔子只在IL2RG和RAG1基因上发生了双敲，在RAG2、Tiki1和ALB基因上没有检测到突变。但在5因子注射的囊胚中，5个基因同时打靶的效率为33.3%，5个基因同时双敲的效率为8.3%。在胚胎移植实验中，只获得了1只后代，可能是由于后代数量太少，没有获得5基因敲除兔，下一步只要移植足够多的胚胎数量，将有可能得到5个基因同时敲除的基因打靶兔子。 在CRISPR/Cas9系统介导的家兔多基因打靶效率建立的实验中，我们获得了IL2RG基因敲除兔——免疫系统缺陷模型兔。我们对这些IL2RG基因敲除兔进行了系统的表型分析，发现这些IL2RG基因敲除兔的免疫系统均发育异常，比如胸腺明显偏小萎缩、发育不全；脾脏有轻微的减小变薄；缺少B淋巴细胞和CD4+/CD8― T淋巴细胞，而CD4―/CD8+ T细胞显著减少但仍有少量残留；血清中IgG和IgM的含量相比于野生型显著降低。 综上所述，我们利用CRISPR/Cas9系统成功实现了对家兔的多基因打靶，建立了家兔多基因打靶技术体系；同时获得了IL2RG基因敲除免疫缺陷兔。我们的结果表明CRISPR/Cas9系统对于家兔多基因修饰研究是一种高效和简便的工具。在本研究中成功建立的免疫缺陷兔模型在评估新药疗效、基因治疗以及异体移植治疗肿瘤的研究领域中将具有很大的应用潜力。 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 90 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1024]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 颜泉梅. CRISPR/Cas9系统介导家兔多基因打靶的研究及IL2RG基因敲除兔的建立[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2014. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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