单核苷酸多态性检测方法的建立及核酸等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用
文献类型：学位论文
| 作者 | 吴薇 |
| 答辩日期 | 2014-04-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 曾令文 |
| 关键词 | 单核苷酸多态性 DNA自组装 核酸试纸条 等温链置换 食源性病原菌 |
| 学位名称 | 理学博士 |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 其他题名 | Construction of Single Nucleotide Polymophysims Detection Strategy and the Application of Isothermal |
| 英文摘要 | 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs) 是最常见的一种人类可遗传变异，对其研究有助于解释个体的表型差异、不同个体和群体对复杂疾病的易感性、对不同环境因子的反应、以及对各种药物的耐受性。随着大量与人类疾病和药物治疗相关的SNP的发现,针对SNP的检测技术也取得了巨大进展。但大多数检测方法都是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， PCR）方法为基础，结合电泳技术，或结合荧光、质谱、酶联免疫等辅助技术。虽然与传统的方法相比，这些新技术检测灵敏度高，但是它们都需要用到实验室特定的仪器，需要专业的技术人员，而且仪器价格昂贵，难以推广到所有实验室应用。因此建立一种简单、便宜、快速的方法可以准确且高通量的对SNP进行筛查具有重要的意义。近年来，DNA自组装技术由于其具有交替使用灵活性、良好生物相容性、操作简单方便、增强检测信号等优点而备受关注，在分子计算、生物物理、纳米技术、分子诊断等各方面的潜力得到了广泛的发掘。本论文研究课题之一是利用DNA单链自组装形成长双链的特性，以荧光分子SYBR Green I为信号物质，构建了一种新型方法用于SNP的检测。目标SNP存在时可介导T4 DNA连接酶将MP（Mediator Probe）探针连接到磁珠上，MP则可启动下游的DNA自组装过程在磁珠上进行，加入的SYBR Green I嵌入长链后发出绿色荧光信号用于检测。该方法通过DNA自组装形成长链作为信号扩增手段，与传统的酶介导信号扩增技术相比，更加简单、方便、快速、经济、背景低且室温下可进行。该方法具有很好的线性关系，对BRAFT1799A突变基因的检测线性范围为0.1 fmol/L-1 nmol/L，检测限是0.1 fmol/L，比已报道的电化学检测方法高10多倍。该传感器具有很好的特异性，其他物质对检测不产生影响，检测结果准确可信，无需专门的技术人员，为SNP定量检测提供一种可靠的新手段。 微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要问题，对食源性疾病的预防与控制已引起了全世界的关注，而食源性病原微生物的检测技术是食源性疾病的预防和控制的关键技术环节。目前病原微生物常见的检测方法包括微生物培养法、免疫学方法、和基因检测方法和对病原体核酸的检测。传统的微生物培养法耗时较长、效率较低；而免疫学检测方法灵敏度不足；分子检测方法是直接对病原体的核糖核酸或脱氧核糖核酸的检测，尽管具有高灵敏度、高特异性的优点，但是它们需对病原微生物的核酸进行提取，操作繁琐，而且需要特殊的仪器用需要专业的培训。此外，它们不能精确反映病原微生物的完整性，在病原体死亡破碎的情况下仍能检测出假阳性结果。因此，寻找准确、快速、灵敏、低成本、操作简易的工具用于病原微生物的检测是非常有意义的。等温链置换扩增（isothermal strand displacement amplification,ISDA）技术近年来迅猛发展，显现出广阔的应用前景。特别是在临床和现场快速诊断技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使得我们对食品微生物的检测诊断得以简便快速并高通量的实现。本论文的另一个研究课题则是建立一种结合等温链置换扩增的方法用于快速、灵敏地检测肠炎沙门菌。扩增模板是能与肠炎沙门菌表面特异性结合的核酸适体（aptamer），从而可以精确地反映病原微生物的完整性，避免因细胞破碎引起的假阳性。以试纸条为检测平台，金纳米颗粒为指示剂，检测结果肉眼可见。该方法的检测灵敏度为 10 CFU/ml，检测前无需进行细菌培养，大大缩短了检测时间，可在1小时内完成。此外，该方法操作简便，不需要使用沙门菌的抗体和昂贵的实验仪器，减少了检测成本。因此，在未来的食源性病原微生物检测中，该方法有望取代传统检测手段。 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 81 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1040]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 吴薇. 单核苷酸多态性检测方法的建立及核酸等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2014. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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