猪内源多能基因Oct4荧光报告系统的建立
文献类型：学位论文
| 作者 | 赖思思 |
| 答辩日期 | 2015-04-01 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 赖良学 |
| 关键词 | 猪 Oct4 荧光报告系统 基因敲入 CIRSPR |
| 学位名称 | 工程硕士 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 其他题名 | Generation of knock-in pigs carrying Oct4-tdTomato reporter system |
| 英文摘要 | 基因修饰猪在农业和生物医药领域具有广泛的应用价值。目前，具有生殖系嵌合能力的猪胚胎干细胞或诱导多能干细胞尚未建立成功，阻碍了对猪基因的高效修饰。建立一个能够检测猪细胞分化状态的报告系统，将大大地促进猪多能细胞建立的研究进展。 Oct4对多能性干细胞的维持和自我更新起着至关重要的作用，是多能性细胞的一个重要标记。建立一个基于Oct4表达的荧光报告系统将有助于我们实时监测细胞的多能性状态。小鼠Oct4荧光报告系统能够区分鼠多能细胞na?ve和primed状态、已广泛用于iPS细胞诱导、胚胎发育等研究。猪Oct4荧光报告系统虽已有报导，但主要是通过将鼠源或猪源Oct4启动子序列连接EGFP作为报告载体转染到猪成纤维细胞获得的。然而，由于报告基因拷贝数的不确定性、插入位点的随机性、物种间调控机制的差异，以及外源Oct4启动子包含的调控元件不完整等因素，使得该报告系统的荧光表达效率个体差异性较大，不可控性较高。为了克服以上不足，我们拟将报告基因定点整合入猪内源Oct4启动子的下游，从而建立一个更加精确、稳定的Oct4表达荧光报告系统。 同源重组（Homologous Recombination, HR）可将外源序列精确敲入至目标位点，但其效率极低，要实现猪基因组编辑极其困难。近年来出现的CRISPR/Cas9系统因其简单、高效的特点，已在多个物种中取得成功应用，为基因定点编辑带来很大突破。因此，本研究中我们结合CRISPR/Cas9系统和传统同源重组方法，对建立靶向猪Oct4报告系统进行了探索。 我们首先构建了针对猪Oct4基因的CRISPR/Cas9-sgRNA载体和同源重组载体，然后将二者共转染猪胎儿成纤维细胞。通过G418筛选，获得223个细胞克隆，其中21个细胞克隆在目标位点检测到2A-Tdtomato序列的插入。将这21个细胞系作为核供体，分别进行核移植，当重构胚胎发育到囊胚后，能够表达较强的红色荧光，初步证明了我们构建的Oct4荧光表达系统是有效的。将克隆胚胎移植到代孕母猪后，将妊娠至35天的一头母猪终止妊娠，获得了5个胎儿。另外一头代孕母猪妊娠到期，产出2头雌性仔猪。经PCR检测，获得的胎儿和仔猪全部在目标位点有2A-tdTomato序列的插入。进一步检测证明，这些胎儿和仔猪全部为杂合体，只在一个同源位点有外源基因敲入。在胎儿生殖脊中，可观察到红色荧光的表达，而在其它组织中未见其表达，证明了我们构建的Oct4荧光载体只在有多潜能细胞中特异地表达。来自克隆胎猪和仔猪的成纤维细胞不表达红色荧光，但将它们作为核供体，进行第二轮SCNT，重构胚胎发育到囊胚后红色荧光再次表达，再次证明我们建立的Oct4荧光表达系统可用于监测猪细胞多能性。我们试图将带有Oct4荧光报告系统的猪成纤维细胞诱导为iPS细胞，但未获得表达红色荧光的细胞系，经检测，内源Oct4基因并没有被激活，外源Oct4基因持续表达，这表明iPS细胞的形态可能是靠外源Oct4基因的表达来维持的，其多能性可能是有限的。 综上，我们结合CRISPR/Cas9技术和同源重组技术，利用体细胞核移植技术第一次通过基因敲入建立了猪内源Oct4基因荧光报告系统。本报告系统模拟了猪内源Oct4基因的表达，在理论上可更加精确地监测细胞多能性状态。本报告系统可用于在体内追踪多能性细胞的迁移和发育状态，也可为分离猪高分化潜能的多能性细胞以及筛选多能细胞体外培养体系提供技术支持。 |
| 学科主题 | 生物工程 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 81 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1080]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 赖思思. 猪内源多能基因Oct4荧光报告系统的建立[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2015. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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