CRISPR/Cas9介导的基因激活系统诱导胚胎干细胞向胚外细胞谱系转换
文献类型：学位论文
| 作者 | 魏姝 |
| 答辩日期 | 2016-03-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 赖良学 |
| 关键词 | 胚胎干细胞 滋养层干细胞 胚胎外内胚层干细胞 CRISPR/Cas9-VP64系统 |
| 学位名称 | 理学博士 |
| 学位专业 | 发育生物学 |
| 其他题名 | Conversion of embryonic stem cells into extraembryonic lineages by CRISPR-mediated activators |
| 英文摘要 | 细胞重编程和细胞转分化技术是再生医学研究领域近十年来最重要的突破，为干细胞治疗提供了更为大量、快速、安全且经济的细胞来源。目前，改变细胞分化命运最常用的方法是通过直接转入特定组合的外源转录因子。例如，过表达多能性四因子Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc能实现体细胞的重编程，获得诱导多能干细胞；过表达神经发育特异的因子Brn2、Ascl1、Myt1l则能诱导神经元的产生。然而，这些传统的方法需要从cDNA文库中调取目的基因，操作繁琐，而且外源基因在细胞内的整合和表达量都难以控制，引起极大的安全隐患，限制了诱导获得的功能性细胞的临床应用。 近年来，CRISPR（Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats）/Cas9技术以其简单、高效的基因编辑能力，为疾病动物模型制作、基因治疗、动植物遗传性状改良、以及生命科学基础研究等提供了一个简单、快速经济的研究方法，大大加速了这些学科领域的进展。通过对Cas9基因特定位点进行突变，可获得仅具有DNA序列识别功能而无内切酶活性的Cas9蛋白（dCas9），将其与转录调控因子例如转录激活因子VP64或者抑制子KRAB进行融合表达，可特异性识别目的基因的转录调控区域，从而对目的基因的表达量进行人工调控。这意味着我们可以通过直接靶向调控内源基因的表达，实现细胞类型之间命运转化的人工控制。 早期胚胎发育包含三种干细胞类型——胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）、滋养层干细胞（Trophoblast Stem Cell，TSC）和胚外内胚层干细胞（Extraembryonic endoderm stem cell，XENC）。这三种细胞具有不同的功能， ESC分化发育为胎儿，TSC分化形成胎盘，而XENC主要形成早期胚胎的卵黄囊结构。ESC的标记基因为Oct4，滋养外胚层能高表达Cdx2， Gata6是XENC形成过程中的关键转录因子。自然条件下，这三种细胞不会相互转化，但在体外培养条件下，利用转基因的方式过表达特异外源关键转录因子基因可实现不同干细胞之间的谱系转换。在本研究中，我们拟利用CRISPR/Cas9介导的基因激活系统诱导这三种不同细胞类型之间的转换。 在ESC向滋养层细胞的分化研究中，为了方便的追踪小鼠内源Cdx2基因的表达，我们首先在 OG2 mESCs中构建了Cdx2报告系统，利用CRISPR/Cas9同源重组技术，在mESCs细胞的Cdx2基因终止密码子前敲入tdTomato荧光报告基因，筛选鉴定之后得到OG-CT mESCs。Cdx2基因表达会使细胞发出红色荧光。我们在无内切酶活性的Cas9蛋白羧基端融合能招募转录起始复合物的转录因子VP64（dCas9-VP64），并分别选择滋养外胚层干细胞和胚外内胚层干细胞的关键基因Cdx2和Gata6作为目标基因，设计多个靶向它们启动子区域的sgRNA，将sgRNA分别和dCas9-VP64质粒进行脂质体共转染mESCs。 当在mESCs中转入dCas9-VP64和针对Cdx2启动子区的sgRNA 后，内源性Cdx2基因得到激活，并高表达。我们成功地获得了具有TSC特性的细胞系，将其命名为cviTSCs。cviTSCs排布紧密，呈上皮样片状；细胞倍增时间长于ESCs，为18-20小时；TSC的标记基因Tcfap2c、Cdx2、Elf5、Tead4、Eomes和Sox2高表达，而多能性因子Oct4和Nanog的表达被抑制；体外分化培养后，cviTSC细胞克隆迅速分化，变为多核（1~16）而巨大的细胞，干细胞基因Cdx2和Elf5的表达迅速下调，海绵丝细胞标记基因Tpbp和分化终末阶段滋养层巨大细胞的标记基因PL1、PL2和Plf大量表达。cviTSC细胞移植到小鼠皮下后，细胞分化为滋养层巨大细胞并侵袭血管造成皮下出血，进而形成皮下血窦。cviTSC移植到四细胞胚胎中，可随着胚胎发育整合到滋养层中，胚胎移植到子宫中进一步发育，cviTSC细胞特异地发育为胎盘细胞而不嵌合到胎儿中。 在ESC中转入dCas9-VP64和针对Gata6启动子区的sgRNA 后，内源性Gata6基因得到激活，并高表达。我们成功的获得了具有XENC特性的细胞系，将其命名为cviXENCs，cviXENCs呈星形或菱形上皮样细胞样生长，边缘清晰明亮，细胞倍增时间为24~27小时；表达XENC标记基因Gata4、Gata6、Hnf3b、Sox7、Pthr1、Afp和Sox17等，而不表达Oct4。嵌合体实验证实cviXENCs仅嵌合于侧壁内胚层区域，而不整合到胚胎中。 综上所述，我们利用CRISPR介导的转录激活因子高效启动ESC的内源基因Cdx2和Gata6基因的表达。从而实现ESC向两种胚外细胞系（即TSC和XENC）的定向分化；并通过标记基因检测以及体、内外分化实验证实，这些诱导细胞是具有完全功能的细胞。 这种通过直接调控内源基因表达，实现细胞谱系之间转换的技术，为建立更加简单和安全的细胞重编程技术提供了新的思路。 |
| 学科主题 | 发育生物学 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 82 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1087]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 魏姝. CRISPR/Cas9介导的基因激活系统诱导胚胎干细胞向胚外细胞谱系转换[D]. 广州生物院. 中国科学院大学. 2016. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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