帕金森综合症猪模型的建立及异种器官移植供体猪的培育
文献类型：学位论文
| 作者 | 周小青 |
| 答辩日期 | 2016-05-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 赖良学 |
| 关键词 | 帕金森症 猪模型 CRISPR/Cas9 异种器官移植 TALEN |
| 学位名称 | 理学博士 |
| 学位专业 | 发育生物学 |
| 其他题名 | Establishment of pig models for Parkinson's syndrome and pig donors for xenotransplantation |
| 英文摘要 | 帕金森综合症猪模型的建立帕金森病（Parkinson's disease，PD）又称帕金森综合症，是一种仅次于阿尔兹海默症（Alzheimer disease,AD）的第二大进行性中枢神经系统退行性疾病，主要表现为静止时颤抖、僵直、动作迟缓、平衡感差等。它的发病人群主要集中于中老年人群，尤其是60岁以上的老人。它的病因目前不明，据推测其发病机制和遗传因素、环境因素以及自身年龄因素相互作用有关。遗传因素主要是指各种疾病相关基因的突变，比如PARK2、PINK1、DJ-1、LRRK2基因等。PINK1和PARK2基因皆为PD相关致病基因，与常染色体隐形遗传早发性PD综合症密切相关，其中单个基因的突变即可诱发早发性PD综合症，然而单个基因突变所诱发的PD症状并不明显，因此我们设想如果同时突变这两个基因是否能加快PD症状的产生或是表现出更好的PD症状。现阶段的帕金森动物模型主要为果蝇、斑马鱼、小鼠和大鼠等小动物模型，无法真实地反应人类帕金森症状。因此我们预备建立一种大动物模型——帕金森模型猪，以便更加真实地模拟人类帕金森病症。与小鼠相比，猪在进化上与人类更为接近，猪的神经系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人类极其相似；相比于大、小鼠的无脑沟和脑回，猪的大脑结构有脑沟和脑回，且容量等与人类大脑非常相似；而且其基因表达模式，病理发生过程更接近于人类。通过对多种神经退行性疾病猪模型的研究发现，猪能模拟出多种小鼠模型无法模拟的疾病表型。因此，猪可以作为一种理想的帕金森综合症动物模型。我们针对猪的PARK2和PINK1基因的外显子分别设计了gRNA，将其和Cas9载体共转染巴马小型猪的胎儿成纤维细胞后，获得了纯合的PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除的细胞系，其双基因的双敲概率高达38.1%。选择状态较好的几株细胞系混合后作为核供体，进行体细胞核移植和胚胎移植。我们总共移植了1729个重组胚胎，分别植入10头代孕母猪，其中有四头怀孕到期并自然分娩，总共产下20头克隆仔猪。经测序鉴定，20头仔猪全部为阳性，即PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除克隆猪。在用PINK1和Parkin抗体进行免疫荧光染色后可发现：WT仔猪大脑中可观察到染色明显的PINK1和Parkin蛋白，而PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除克隆仔猪的大脑组织中检测不到PINK1和Parkin蛋白的表达，表明PINK1和PARK2基因的敲除确实导致其编码蛋白的缺失。历经一年半的培育，我们现已获得了F1代18头，其中10头公猪，8头母猪，皆为PARK2和PINK1基因单敲，即杂合子，表明PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除克隆猪的突变是可以生殖系遗传的。本次研究获得的PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除克隆猪可作为帕金森症大动物模型，用于研究其发生机制和评估相关治疗药物的有效性和安全性；并且本次研究将新兴的CRISPR/Cas9技术与体细胞克隆相结合，不仅使猪基因打靶效率更高、更为精确，而且在一个世代内首次实现了大动物双基因的等位敲除。该技术路线的建立将大大加速多基因修饰猪制备，对农业而言，可促进猪的生产性能的改良；对于生物医药领域，也可加速大动物疾病模型的建立。 异种器官移植供体猪的培育器官移植是20世纪最伟大的医学成就之一，随着外科医学的快速发展和免疫抑制剂的开发利用，同种器官移植挽救了成千上万器官衰竭患者的生命，但器官资源的严重短缺阻碍了同种器官移植的广泛应用。据统计，目前欧美国家等待移植的病人有600多万人，新病人还在不断增加。发达国家的器官供应只能满足15%的需要，约五分之一的病人在等待中死亡。日益突出的器官资源供求矛盾使异种器官移植研究应运而生。科学家们普遍认识到如果动物器官也能用于器官移植的话，那器官的来源问题将不再是难题。目前，已有多种大动物被应用于异种器官移植，如猪，猴，猩猩，狒狒等，其中又以猪的研究最为广泛。以猪的器官作为异种供体来源，缘于其得天独厚的条件：猪的同类器官与人的器官生理、大小和形态等基本相似；猪的繁殖周期短，生产力高，一窝产仔多；与灵长类动物相比伦理问题相对较少且传染病风险较低。因此猪是理想的异种器官移植的供体来源。超急性排斥（HAR）是异种器官移植的主要障碍，敲除合成主要异种抗原的a 1，3-半乳糖基转移酶基因（GGTA1）可有效地解决HAR。将GGTA1敲除猪的器官移植到灵长类身上能存活好几个月甚至更长时间，有效地克服了HAR，然而后期的急性排斥和慢性排斥依然无法忽视。异种器官移植过程中，NK细胞、CD4+和CD8+T细胞等免疫细胞的功能状态决定了移植物的命运。HLA-G作为一种免疫耐受分子，可与这些免疫细胞表面的特异性受体相互作用，抑制受体的免疫应答作用，延长移植物的存活时间，在移植免疫耐受产生与维持中发挥重要作用。本课题采用TALENs基因打靶技术，对分离出的巴马猪胎儿成纤维细胞进行GGTA1基因敲除的同时转入HLA-G5基因，通过SCNT获得GGTA1-/-/HLA-G5+克隆猪。我们总共移植了1997个重组胚胎，分别植入12头代孕母猪，其中有7头成功怀孕到期并自然分娩，总共产下20头克隆仔猪。经测序鉴定，20头仔猪皆为阳性，不过一半为GGTA1-/-/HLA-G5+克隆猪，另一半为GGTA1-/-/HLA-G5- 克隆猪。对来自GGTA1-/-/HLA-G5+克隆猪的细胞和组织进行免疫组化和流式分析，可发现其各组织和细胞表面的Gal表位已经被成功敲除；Western Blot和免疫荧光等也表明转基因HLA-G5在克隆猪全身各组织广泛表达，且MTT实验证实GGTA1-/-/HLA-G5+克隆猪的细胞在含补体的正常人血清中具有更高的免疫耐受性。这无不说明我们获得的GGTA1-/-/HLA-G5+克隆猪比野生型，甚至是简单的GGTA1敲除猪更适合用做异种器官移植供体。本研究首次进行基因打靶和转基因的同时尝试，不仅证实了多种基因修饰技术同时进行的可行性，为多种基因修饰手段的同时运用提供了借鉴；同时培育了具有重要科研价值和应用前景的基因敲除和转基因GGTA1-/-/HLA-G5+克隆猪，为异种器官移植提供重要的研究工具和新的研究途径。 |
| 学科主题 | 发育生物学 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 100 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1113]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 周小青. 帕金森综合症猪模型的建立及异种器官移植供体猪的培育[D]. 广州生物院. 中国科学院大学. 2016. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
浏览0
下载0
收藏0
其他版本
除非特别说明，本系统中所有内容都受版权保护，并保留所有权利。