应用 MBD 蛋白的 DNA 甲基化及甲基转移酶活性检测方法研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 王琳 |
| 答辩日期 | 2016-04-01 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 曾令文 |
| 关键词 | MBD蛋白 DNA甲基化 甲基转移酶 ELISA 生物传感器 |
| 学位名称 | 工程硕士 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 其他题名 | Studies of DNA Methylation and DNA Methyltransferase Activity Detection Strategies using MBD Protein |
| 英文摘要 | DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰之一。它由DNA甲基转移酶催化，使DNA的CpG二核苷酸中的胞嘧啶添加甲基基团。从而在不改变DNA序列的情况下对基因的表达实施调控，在胚胎发育、细胞分化和衰老、肿瘤发生等许多生命活动中发挥重要的作用。抑癌基因启动子特殊位点的甲基化状态、基因组整体甲基化水平和甲基转移酶活性对癌症的发生和发展均有重要影响。对其快速、有效的检测可为肿瘤诊断、分级、治疗提供参考。目前检测 DNA甲基化和甲基转移酶的方法通常需要亚硫酸氢盐或甲基化敏感限制性内切酶预处理，不仅费时费力，还需要复杂仪器和专业操作。因此，建立灵敏度高、准确性好又简便经济的DNA甲基化和甲基转移酶检测方法意义重大。本文利用甲基化CpG结合蛋白（MBD蛋白），建立了一种基于ELISA平台的DNA甲基化及甲基转移酶活性检测方法。通过在酶标板上固定甲基化修饰的检测探针，和特异结合DNA甲基化位点的MBD重组蛋白，分别对待测DNA序列和甲基化位点进行识别，并结合形成夹心复合物，来实现对靶标的检测。该检测方案利用了传统的ELISA检测平台，具有通用性，检测操作步骤简单、选择性好，对甲基化DNA的检测范围为5~50nM，检测下限达到2.6nM；对甲基转移酶M.Sss I 的检测范围为0.1~2 unit/孔，最低可检测到0.08 unit/孔。本文还构建了一种基于胶体金的快速检测方法。利用胶体金标记的检测探针和MBD重组蛋白，识别甲基化的DNA并与之结合形成夹心复合物。该复合物在检测试纸上因毛细作用向另一侧层析，在检测试纸的检测线处被预包被的标签抗体捕获，形成一条红色的检测线。当剩余胶体金颗粒层析至质控线处，形成第二条质控线，指示检测过程正常进行。该胶体金检测方法具有选择性好、操作简单、检测快速、无需复杂仪器设备、成本低廉等优点。对甲基化DNA的检测范围为100nM~100μM，检测下限为100nM；对甲基转移酶M.Sss I 的检测范围为2~50 unit/mL，检测限为2 unit/mL。 |
| 学科主题 | 生物工程 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 60 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1119]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王琳. 应用 MBD 蛋白的 DNA 甲基化及甲基转移酶活性检测方法研究[D]. 广州生物院. 中国科学院大学. 2016. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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