ALS人多能干细胞疾病模型的建立及SPT4调控含有过长TNRs基因的作用研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 姚姣 |
| 答辩日期 | 2017-04-01 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 潘光锦 |
| 关键词 | ALS TDP-43 人多能干细胞 ES 运动神经元 MN HD SCA HTT SPT4 iPSC CRISPR/Cas9 |
| 学位名称 | 工程硕士 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 其他题名 | Establishment of human pluripotent Stem Cell Disease Modeling in ALS and Study on The Effect of SPT4 in Regulating gene with Multiple TNRs |
| 英文摘要 | 神经退行性疾病如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、亨廷顿舞蹈病（HD）、脊髓小脑共济失调（SCA）的治疗现今仍是世界难题，目前缺乏有效的治疗措施，因此建立神经退行性疾病模型对于研究神经退行性疾病的发病机理及其治疗具有重要意义，本研究构建了基于人多能干细胞的ALS疾病模型和人诱导多能干细胞的HD、SCA3疾病模型，并对其表型和治疗策略展开了研究。ALS是一种引起运动神经元变性的渐进且致命的神经退行性疾病，在大部分ALS病人中均发现了TDP-43的异常。家族性ALS中TDP-43基因突变的发现对于研究TDP-43在ALS中的病变机理提供了机会。这里，我们通过CRISPR/Cas9技术在TDP-43内源基因分别引入突变A315T和M337V，构建了两个TDP-43突变的细胞疾病模型。qPCR检测和流式细胞术分析结果表明，两种TDP-43突变均不改变人胚胎干细胞（hESCs）的多能性；免疫荧光结果显示，TDP-43A315T、TDP-43M337V突变和野生型细胞在第28天均能分化为ChAT阳性的运动神经元。对分化28天的运动神经元的细胞凋亡程度、神经元胞内TDP-43的定位及表达水平进行分析，结果表明TDP-43突变的运动神经元相比于与正常的运动神经元，以上检测指标均无明显差异，表明两种TDP-43突变均不影响该基因在分化28天的运动神经元中的表达水平及运动神经元的存活率。基于体外诱导的运动神经元处于发育早期的特性，本研究以上实验现象与ALS疾病的迟发性相符合。在今后实验中，需要对运动神经元进行长期诱导，以得到更成熟的运动神经元，同时采用细胞压力因子作用于运动神经元，观察TDP-43突变对运动神经元功能的影响，从而探索TDP-43突变导致ALS的致病机理。SPT4是一种转录延伸因子，能帮助RNA聚合酶II稳定DNA模板或者DNA/RNA杂合链，对于长TNRs（三核苷酸重复）的转录具有重要作用。HD和SCA3疾病的发生分别由于HTT基因和ATNX3基因含有过长的TNRs，使到HTT蛋白和Ataxin-3蛋白中的多聚谷氨酰胺肽链异常扩展，导致了两种疾病的受累神经元的大量死亡。早期的研究工作表明，在酵母和小鼠中干扰转录延长因子SPT4的表达能够降低突变的HTT基因的转录，但对正常的HTT基因的转录没有任何影响。通过基因工程技术改变SPT4的表达水平，有望成为治疗多聚谷氨酰胺疾病的一种潜在手段。为研究SPT4表达水平的改变是否会降低HD疾病中突变HTT基因及SCA3疾病中ATNX3基因的mRNA和蛋白表达水平，如果有下降，那么这样的下降是否会改善TNR扩增所引起的疾病表型，本研究对HD和SCA患者来源的iPSCｓ的SPT4基因进行了敲除。本研究发现在进行基因敲除的过程中，在人iPSC和ESCs中均无法得到SPT4双等位基因敲除的细胞株，只能获得SPT4单等位基因敲除的杂合子，提示SPT4基因的缺失存在导致人多能干细胞（hPSCs）死亡的可能性，SPT4蛋白对于hPSCs存活的必要性需要进一步的研究证明。免疫印迹结果表明，在SPT4单等位基因敲除的细胞中，尽管SPT4基因的mRNA水平被降低了50%，但是SPT4蛋白表达水平没有显著的改变。为了达到降低SPT4蛋白表达水平的目的，本研究在iPSCｓ中对SPT4基因进行敲降。qPCR结果表明SPT4的mRNA水平已敲降至原表达水平的1/4，但免疫印迹结果却显示SPT4的蛋白水平仍然下降得不明显。因此，HTT和SCA3的mRNA表达水平并未有所下降。在今后试验中，将对SPT4进行可诱导性敲除，以达到SPT4完全敲除的目的。 |
| 学科主题 | 生物工程 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 84 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1126]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 姚姣. ALS人多能干细胞疾病模型的建立及SPT4调控含有过长TNRs基因的作用研究[D]. 广州生物院. 中国科学院大学. 2017. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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