肾脏缺陷猪模型的建立及猪胚胎补偿技术探索
文献类型：学位论文
| 作者 | 江飞 |
| 答辩日期 | 2017-05-01 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 赖良学 |
| 关键词 | 人源化器官 肾脏缺陷模型猪 囊胚补偿 CRISPR/Cas9 |
| 学位名称 | 理学硕士 |
| 学位专业 | 发育生物学 |
| 其他题名 | Establishment of kidney defect pig model and exploration of pig embryo compensation technology |
| 英文摘要 | 器官移植是20世纪最伟大的医学成就之一，随着临床医学的快速发展和免疫抑制剂的开发利用，通过器官移植挽救了成千上万器官衰竭患者的生命。但能够用于移植的供体器官资源严重短缺。据统计全世界急需进行器官移植手术的病人数量与所捐献的人体器官数量之比是20∶1。在我国，器官短缺现象更为严重，供需比为1:100。器官移植供体的严重短缺已成为一个世界性的难题。为解决供体器官严重短缺现象，科学家把目光投向异种器官来源。猪器官大小和生理结构与人体器官较为相似，被认为是异种器官的最佳来源。一方面可以对猪进行免疫排斥相关基因修饰使猪器官适于移植人体。另一方面，可以通过基因敲除，建立器官缺陷猪模型，利用人多能性干细胞对器官缺陷胚胎进行补偿，在器官缺陷猪体内再生人体器官即人源化器官，用于人体器官移植。在2002年已对猪器官移植人体引起超急性免疫排斥反应基因进行敲除，但基因修饰的猪器官至今尚未应用于人体器官移植。以修饰方式来解决异种器官移植的诸多免疫排斥问题还有大量的难题需要去攻克。人源化器官研究还处于起步阶段，目前异种器官再生只可以在大鼠/小鼠之间实现，能否在器官缺陷猪体内长出人体器官还未知。在所有的器官移植中，肾脏移植最多，肾脏移植技术最为成熟，对肾脏器官需求量最大。因此，在本研究中我们将建立肾脏缺陷猪模型，并对猪胚胎补偿技术进行探索，为人源化器官研究奠定基础。在基因选择方面，我们选择Sall1和Emx2这两个与肾脏发育相关基因。Sall1表达于后肾间充质，敲除Sall1后，新生小鼠出生后由于肾脏缺陷很快死亡。在临床上，Sall1基因突变也会导致人肾脏发育缺陷。Emx2基因表达于泌尿生殖系统的上皮部分，纯合Emx2基因敲除小鼠会因为泌尿生殖系统发育不完全而死亡，表现为缺乏肾脏、输尿管、生殖腺和生殖道。Sall1和Emx2基因对于肾脏的发育起到至关重要的作用，并且Sall1和Emx2基因在进化中高度保守。在本研究中我们利用CRISPR/Cas9技术通过敲除Sall1基因和Emx2基因建立肾脏缺陷模型猪。首先我们设计构建打靶gRNA载体，并与Cas9质粒共转染巴马猪胎儿成纤维细胞，然后利用G418筛选结合测序分析得到Sall1基因敲除阳性单克隆8株，Emx2基因敲除阳性单克隆4株；其次将Sall1和Emx2双敲除细胞通过体细胞核移植构建重构胚胎，在体外发育24小时后混合移植至代孕受体，共移植代孕受体7头；最后在移植57天时解剖获得2头Emx2双敲除基因型胎儿；Emx2双敲除基因型胎儿肾脏与同时期WT胎儿肾脏相比形态异常，发育不完全，体型较小；将Emx2双敲除基因型胎儿的肾脏通过石蜡切片和HE染色发现，猪Emx2基因敲除后导致其肾脏肾小管畸形、不规则和膨大，肾间质纤维化，肾小管有蛋白质结晶形成。这说明敲除猪Emx2基因后会导致其肾脏发育缺陷。同期实验未获得Sall1基因敲除猪。以肾脏缺陷猪模型进行人源化器官研究，需通过胚胎补偿进行嵌合研究。因此，在建立肾脏缺陷猪模型的同时，我们对猪胚胎补偿技术进行了初步探索。利用四色荧光猪细胞和巴马猪胎儿成纤维细胞通过体细胞核移植技术构建重构胚胎；在重构胚胎体外培养24小时后，挑取2-cell胚胎去除透明带，并按2+2的比例将2种去除透明带胚胎置于微孔进行胚胎聚合培养；4天后，挑取成功嵌合的囊胚移植至代孕受体，成功获得了嵌合体猪。综上所述，本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除猪Emx2基因，成功获得了肾脏发育缺陷猪，验证了通过Emx2基因敲除建立肾脏缺陷猪模型的可行性；并对猪胚胎补偿技术进行初步探索，通过2细胞期胚胎聚合的方式，成功获得了嵌合体猪。本研究成果将为再生人源化肾脏研究奠定基础。 |
| 学科主题 | 发育生物学 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 69 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1142]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 江飞. 肾脏缺陷猪模型的建立及猪胚胎补偿技术探索[D]. 广州生物院. 中国科学院大学. 2017. |
入库方式： OAI收割
来源：广州生物医药与健康研究院
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