鳜凋亡相关基因的克隆与功能研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 高原 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2006-07-05 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 授予地点 | 水生生物研究所 |
| 导师 | 聂品 |
| 关键词 | 细胞凋亡 鳜 鳜肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 鳜肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的诱骗受体 鳜Mst3和SOK1相关激酶 基因超表达 |
| 中文摘要 | 鳜（Siniperca chuatsi）是我国一种重要的淡水养殖鱼类，但是各种疾病的发生严重影响着其产量，免疫防治是控制疾病的重要而有效的途径。细胞凋亡是鱼类非特异性免疫调节的一个重要方面，本文对鳜凋亡相关基因进行了克隆鉴定及功能研究。 通过构建SMART cDNA文库并结合RACE技术首次在鳜中克隆到三个凋亡相关基因，并采用PCR和Genome Walking的方法克隆这三个基因及其启动子区域。鳜肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（ScTRAIL）基因cDNA全长1359 bp，5′和3′非翻译区分别为112 bp和395 bp，开放阅读框包含852 bp，编码283 aa，基因全长9021 bp，含有6个外显子和5个内含子。启动子区域732 bp，缺乏典型的TATA或CAAT结构，但存在Oct-1、Sp-1、NF-1、RAP-1、C/EBPalp、NF-kappaB和AP-1等潜在的转录因子结合位点。 鳜肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的诱骗受体（ScDcTRAILR）基因，cDNA全长2494 bp，5′和3′非编码区分别为106 bp和1326 bp，开放阅读框包含1062 bp，编码353 aa，基因全长10437 bp，含有10个外显子和9个内含子。启动子区域804 bp，缺乏典型的TATA框或CAAT盒，但有一些特异的转录因子结合位点，如C/EBPalp、Sp-1、Oct-1和GATA-1等。 鳜Mst3和SOK1相关激酶（ScMASK）基因，cDNA全长1743 bp，5′和3′非编码区分别为161 bp和364 bp，开放阅读框包含1218 bp，编码405 aa，基因全长8561 bp，包含有9个外显子和8个内含子。启动子区域1526 bp，缺乏典型的TATA框或CAAT盒，存在Oct-1、Sp-1、NF-1、RAP-1、C/EBPalp、NF-kappaB和AP-1等潜在的转录因子结合位点。Southern blotting分析表明在鳜基因组中，ScTRAIL基因为单拷贝基因，在此基础上采用荧光定量PCR方法揭示ScDcTRAILR和ScMASK基因也是单拷贝基因。 对三个基因转录和表达产物的器官组织分布进行了详细的分析。RT-PCR表明这三个基因在健康鳜组织中呈组成型表达，且三者具有不同的组织分布模式。分别构建ScTRAIL、ScDcTRAILR和ScMASK基因的原核表达质粒，通过原核表达、表达蛋白纯化、并制备多克隆抗体，对头肾、肾脏、肝脏、脾脏、肠、皮肤、心脏、脑、鳃和心脏等器官中的目的基因蛋白进行的免疫印迹，发现ScTRAIL蛋白分布于各个组织中，在头肾、性腺中显示较强的带，在脑中的带较弱。ScDcTRAILR蛋白在脾脏、脑、心脏和鳃中有明显的分布，在其它组织中带很弱或没有。ScMASK蛋白在鳃、肝脏、脑中有明显的带被标记。 模拟病原感染的情况，采用荧光定量PCR中的相对定量方法分析这三个基因在LPS或PolyI:C诱导后变化表达，发现ScTRAIL的表达在诱导前后变化不明显。ScDcTRAILR在LPS诱导组的头肾中呈上调表达，在肝脏、脾脏、肾脏、皮肤和心脏中下调；在PolyI:C诱导组，该基因表达量在头肾、肾脏中有显著的上调，在肝脏、心脏中有较大的下调。ScMASK基因的表达在两个诱导组中的头肾和心脏中有明显的上调，在Poly I:C刺激下，肝脏和脾脏中也检测到该基因的上调表达，在其它组织中则有下调趋势。 利用荧光显微镜观察、核酸电泳以及流式细胞术等方法研究了ScTRAIL、ScDcTRAILR和ScMASK在Hela细胞中超表达对细胞的影响。ScTRAIL和ScMASK基因具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。ScDcTRAILR在Hela细胞中不能引起细胞发生凋亡现象。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-11-16 |
| 页码 | 120 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/11968]  |
| 专题 | 水生生物研究所_中科院水生所知识产出（2009年前）_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 高原. 鳜凋亡相关基因的克隆与功能研究[D]. 水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所. 2006. |
入库方式： OAI收割
来源：水生生物研究所
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