蛙虹彩病毒两个新基因3β-HSD和PCNA的克隆及特征分析
文献类型：学位论文
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| 作者 | 孙伟 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2007-06-15 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 授予地点 | 水生生物研究所 |
| 导师 | 张奇亚 |
| 关键词 | 虹彩病毒 蛙虹彩病毒（RGV） 3β-羟基类固醇脱氢酶 增殖细胞核抗原 转录分析 亚细胞定位 细胞凋亡 |
| 其他题名 | Molecular Cloning and Characterization of Two Novel Viral Genes, 3β-HSD and PCNA, from Rana Grylio Virus |
| 中文摘要 | 蛙虹彩病毒（Rana grylio virus, RGV）是本实验室从患病沼泽绿牛蛙中分离到的病毒病原，为虹彩病毒科蛙病毒属的成员。本文试图在分子水平对RGV的功能基因进行探索性研究，为病毒的防治提供理论基础。从RGV克隆到两个新基因，并对其进行了特征分析和功能探索，主要结果如下： 1、对RGV 3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD）基因进行了转录、亚细胞定位等特征分析和过量表达的功能研究。 （1）RGV 3β-HSD基因的ORF全长1068bp，编码一个长为355aa，分子量大小为39.3KDa的推定蛋白。氨基酸序列同源搜索及比对表明，RGV 3β-HSD的氨基酸序列与蛙（Xenopus laevis）3β-HSD同源性最高，达到47%；其氨基酸序列中含有与3β-HSD功能密切相关的保守氨基酸和模体（motif）。 （2）通过RT-PCR和5′-RACE分析表明，RGV 3β-HSD基因在感染后4h即从翻译起始密码子ATG上游第19个核苷酸处开始转录，在感染后4h至48h一直保持高水平转录。用放线菌酮（cycloheximide, CHX）和阿糖胞苷（cytosine arabinoside, AraC）进行药物抑制实验，揭示RGV 3β-HSD基因是立即早期（immediate early, IE）基因。 （3）通过真核转染和荧光显微镜观察，显示RGV 3β-HSD在鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini, EPC）、肥头鲤细胞（fathead minnow, FHM）和幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney, BHK-21）中均定位于细胞质。采用两种质粒共转染和激光共聚焦显微镜观察，表明RGV 3β-HSD与细胞线粒体共定位，这是关于病毒编码的3β-HSD具有不同于脊椎动物3β-HSD的亚细胞定位的首例报道。 （4）由真核转染和G418筛选得到过量表达RGV 3β-HSD的EPC细胞（EPC/pcDNA3.1-HSD）和转染空载体的EPC对照细胞（EPC/ pcDNA3.1）。经形态学观察和MTT实验，表明过量表达RGV 3β-HSD能显著抑制RGV和大菱鲆弹状病毒（Scophthalmus Maximus Rhabdovirus, SMRV）感染导致的细胞死亡。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术分析，揭示过量表达RGV 3β-HSD能够显著抑制SMRV诱导的细胞凋亡，表明RGV 3β-HSD是一个新型的凋亡抑制因子。 2、对RGV增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）基因进行了基因结构、转录和细胞内定位等特征分析。 （1）RGV PCNA基因的ORF全长738bp，编码一个长为245aa，理论分子量为26KDa的蛋白。氨基酸序列同源搜索显示，RGV PCNA的氨基酸序列和真核生物PCNA的同源性很低，与蛙（Xenopus laevis）PCNA同源性最高仅为18%。通过二级结构分析，表明RGV PCNA具有其它真核生物PCNA所特有的二级结构。 （2）将RGV PCNA基因插入到表达质粒pET32a中，构建了原核表达重组质粒pET32a-PCNA。将其转化表达宿主菌并诱导表达，经SDS-PAGE分析，在预计大小处有明显的融合蛋白表达条带。进一步采用Ni-IDA His•Bind亲和层析柱对重组蛋白进行了纯化，获得了较高纯度的重组蛋白。用纯化的重组蛋白作为抗原免疫小鼠，制备了鼠抗RGV PCNA抗血清。 （3）通过RT-PCR和western blot分析表明，RGV PCNA基因在感染后4h即开始转录并合成蛋白，并且在感染后4h至48h持续进行转录及合成蛋白。CHX和AraC药物抑制实验表明，RGV PCNA基因是晚期（late, L）基因。 （4）通过真核转染和荧光显微镜观察，表明RGV PCNA在EPC、FHM、BHK-21三种细胞内均分布于细胞质中。进一步采用免疫荧光细胞化学显示，在病毒感染后的细胞中，RGV 表达的PCNA特异性的与病毒装配位点的病毒核酸共定位，表明RGV PCNA可能是一个与病毒核酸相互作用的蛋白。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-11-16 |
| 页码 | 139 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12128]  |
| 专题 | 水生生物研究所_中科院水生所知识产出（2009年前）_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 孙伟. 蛙虹彩病毒两个新基因3β-HSD和PCNA的克隆及特征分析, Molecular Cloning and Characterization of Two Novel Viral Genes, 3β-HSD and PCNA, from Rana Grylio Virus[D]. 水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所. 2007. |
入库方式： OAI收割
来源：水生生物研究所
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