柱状黄杆菌缺失突变株的构建
文献类型：学位论文
| 作者 | 张立强 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2009-06-04 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 授予地点 | 水生生物研究所 |
| 导师 | 聂品 |
| 关键词 | 柱状黄杆菌 自杀质粒 滑动基因 蔗糖筛选 |
| 其他题名 | Construction Deletion Mutant Strain of Flavobacterium colunmare |
| 中文摘要 | 柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）是鱼类柱形病（Columnaris disease）的病原，该菌在淡水中分布广泛，可感染野生、养殖及观赏的各种冷水和热带鱼类。柱状黄杆菌主要感染鱼类的鳃组织，导致大面积的鳃部坏死；也会感染体表组织导致引起体表溃烂。 为鉴定可能毒力因子的功能，本研究就构建滑动基因GldH（AY781295）的缺失突变子的可行性进行了研究。本研究依据overlap PCR、启动子的鉴定、自杀质粒的构建、结合转移、同源重组及蔗糖负选择的方法来构建滑动基因GldH的缺失突变子。通过overlap PCR获得了大小为1658bp的滑动基因GldH的的缺失片段ΔMH，该片段为GldH内部缺失了一小段，但是却不发生移码的序列，这样也就保证了突变为非极性突变。通过氯霉素抗性筛选，鉴定了一段327bp的含胶原蛋白酶启动子的序列，该序列位于柱状黄杆菌胶原蛋白酶基因（EF501979）起始密码子前，可启动氯霉素基因的表达并赋予大肠杆菌17μg/ml浓度的氯霉素抗性。依据上述胶原蛋白酶基因启动子，本研究构建了该启动子与氯霉素基因ORF的融合片段，并将此融合片段替换了自杀质粒pRE112的氯霉素基因片段，在连接入滑动基因GldH的的缺失片段ΔMH后得到了新的自杀质粒pREFC－ΔMH。将自杀质粒pREFC－ΔMH转化到大肠杆菌S17-1(λpir)，然后与对数生长期的柱状黄杆菌进行结合转移。24小时后通过双抗平板（cm 3.4μg/ml, To 1μg/ml）来筛选基因组整合有质粒pREFC－ΔMH的柱状黄杆菌，结果表明质粒pREFC－ΔMH成功整合到了柱状黄杆菌基因组中。将上一步得到的柱状黄杆菌进行多次传代，然后涂含10%蔗糖的Shieh平板以筛选发生了第二次同源重组的突变子，结果未筛选到发生了第二次同源重组的突变子。 另外，本研究分析了柱状黄杆菌细胞和细胞裂解物对FALPGPA（胶原蛋白酶特异性底物）的降解活性，两者结果都表明柱状黄杆菌具有水解胶原的能力。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-11-16 |
| 页码 | 85 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12384]  |
| 专题 | 水生生物研究所_中科院水生所知识产出（2009年前）_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 张立强. 柱状黄杆菌缺失突变株的构建[D]. 水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所. 2009. |
入库方式： OAI收割
来源：水生生物研究所
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