鱼类C1q-like和Mtmr8基因的表达及功能分析
文献类型：学位论文
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| 作者 | 梅洁 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2009-05-31 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 授予地点 | 水生生物研究所 |
| 导师 | 桂建芳 |
| 关键词 | C1q-like因子 滤泡细胞 皮质颗粒 凋亡 原始生殖细胞 斑马鱼 血细胞生成 Mtmr8 actin纤维组装 肌肉发生 血管发生 |
| 其他题名 | Expression and Functional Analysis of C1q-like and Mtmr8 in Fish |
| 中文摘要 | 在脊椎动物中，含有C1q结构域的C1q家族蛋白已有一些报道，但他们的生物学功能还不是很清楚。首先，我们鉴定了一个银鲫C1q-like因子(CagOC1q-like)，它已被确认为一种皮质颗粒组分。免疫荧光定位显示CagOC1q-like特异在滤泡表皮细胞上表达，并在完全长成的卵母细胞上同皮质颗粒一起。而且受精后，它会排出到卵黄周隙和卵膜上。由于它是第一个被发现在卵母细胞周围的滤泡细胞上表达的C1q家族成员，它被用于滤泡细胞凋亡和缺失的检测中。卵母细胞成熟和排出阶段，滤泡细胞凋亡和缺失的整个细胞学过程可以清楚地通过CagOC1q-like抗体免疫标记滤泡细胞以及TUNEL标记凋亡滤泡细胞共标记来观察。 C1q-like因子在彩鲫（CaOC1q）和银鲫（CagOC1q）中分子特征几乎相同。然而，它在成熟卵子中的转录水平却有差异，前者的转录水平明显高于后者。有趣的是，CagOC1q在卵子排出后至心跳期之间几乎检测不到表达，而CaOC1q的表达水平相对比较高。整体RNA原位杂交显示心跳时CaOC1q特异在胚胎的生殖脊处表达，而CagOC1q几乎没有表达。为了研究C1q-like因子在胚胎发育过程中的作用，我们设计了反义吗琳代低聚核甘酸C1q-like MO作用于CaOC1q和CagOC1q的翻译起始位点。C1q-like的敲降会造成彩鲫胚胎PGCs的大量减少，而银鲫胚胎PGCs数目并没有明显变化。本研究或许能为揭示C1q家族成员在生殖和发育过程中的功能提供新的线索。 我们进一步在模式生物斑马鱼中来研究C1q-like的功能。通过对斑马鱼的基因组，cDNA和EST数据的全面搜索，我们找到了和CaOC1q-like factor同源性最高的基因，斑马鱼C1q-like，并对它做进一步的功能研究。C1q-like的转录和翻译在斑马鱼胚胎发育早期呈广泛的分布，随后主要在中后脑和眼睛部位表达。体外研究表明，在EPC细胞中，C1q-like能通过抑制caspase 3/9的活性来抑制ActD和CHX诱导的凋亡。进一步通过morpholino调节的敲降技术来探讨C1q-like在胚胎发育过程中的生理功能。与注射对照morpholino的胚胎相比，C1q-like敲降胚胎的头部及其软骨发生呈现明显的缺陷。这些缺陷是由于p53诱导的凋亡造成的，体外转录的C1q-like mRNA或p53 MO共注射能挽救这些缺陷可以验证。TUNEL分析揭示在C1q-like敲降胚胎中产生大量的凋亡细胞，而且caspase 3/9的活性也有两倍以上的升高，这些可以被p53 MO共注射所抑制。荧光定量PCR显示，一些凋亡调节因子如p53, mdm2, p21, Bax 和 caspase 3在C1q-like敲降胚胎中有明显上调，而hbae1则显著下调。在斑马鱼胚胎中，敲降C1q-like会减少血红素产物并且造成中脑静脉及其它脑部血管组装缺陷。有趣的是，斑马鱼胚胎用UV诱导损伤会促使C1q-like mRNA的表达上调，但仅仅C1q-like的过表达不足以抵抗UV诱导的损伤。另外，用嗜水气单胞菌感染胚胎也会促使C1q-like mRNA的表达上调，C1q-like敲降胚胎的存活率显著下降。这些数据表明，在斑马鱼胚胎发育过程中，特别是脑部发育，C1q-like可能起着保护作用，抵抗p53依赖性和caspase 3/9调节的凋亡。C1q-like应该是斑马鱼胚胎发育过程中一个新的细胞存活调节因子。 最近的研究表明，至少有四个人类肌管素（myotubularin）家族基因的突变会造成神经性肌肉紊乱，如MTM1, MTMR1, 2和13。但是它们的信号通路和调节机制还不清楚。这里，我们报道了斑马鱼Mtmr8在胚胎肌肉发生过程中所扮演的新角色。在体节发生早期，Mtmr8主要在眼部和体节部位表达。morpholino敲降造成的Mtmr8功能缺失会导致严重的体节发生缺陷。并且我们发现在Mtmr8敲降的胚胎中，Akt的磷酸化水平明显上升。接着我们探讨了Mtmr8蛋白中PH/G结构域的功能。仅仅PH/G结构域的缺失并不会造成明显的胚胎发育缺陷，但同时加入PI3K的抑制剂LY294002后会产生明显的缺陷表型，这表明PH/G结构域对于Mtmr8的功能非常重要。我们进一步观察了Mtmr8和PI3K在actin纤维组装和肌肉发生过程中的协同作用。加入LY294002后，Mtmr8及其PH/G结构域缺失的胚胎中actin细胞骨架会进一步去组装。另外，我们揭示Mtmr8通过Hedgehog，并以非细胞自动方式来调节actin组装。以上这些数据显示Mtmr8与PI3K共同作用调节斑马鱼actin组装和肌肉发生，而且Hedgehog途径参与其中。这为研究MTM家族成员的生理功能提供新的线索。 胚胎的血管和肌肉形态发生系统是紧密协调的，且最近的研究揭示一些信号通路同时控制这两个系统，如Hedgehog和PI3K途径。在前面的研究中，我们揭示了Mtmr8通过Hedgehog和PI3K/Akt途径来调节早期肌肉发生的功能作用。Mtmr8稍后在血管中的表达暗示了它在斑马鱼胚胎发生中有更广泛的功能。Mtmr8敲降造成严重的血管发生缺陷，包括节间血管生成的阻滞和躯干背部动脉生成的阻断。而背部动脉是造血干细胞生成的地方，这也造成血细胞生成的减少。此外，Mtmr8敲降胚胎的背部动脉的内皮细胞呈现出大量的减少，通过动脉标记基因EphrinB2a的减少或消失表达来指示。而Mtmr8敲降胚胎的EphrinB2a表达缺陷可通过低浓度PI3K抑制剂处理或dnPKA和Vegf mRNA共注射来挽救。而且，当用PI3K或Hedgehog途径的抑制剂处理野生型胚胎时，它们会消除动脉标记基因的表达，但Mtmr8反而迁移至动脉处表达。这些数据表明，Mtmr8可能通过抑制PI3K的活性，从而对动脉的分化起着保护作用，且作为Hedgehog/PI3K/VEGF级联信号控制动静脉命运过程中的一个新组分。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-11-16 |
| 页码 | 135 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12424]  |
| 专题 | 水生生物研究所_中科院水生所知识产出（2009年前）_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 梅洁. 鱼类C1q-like和Mtmr8基因的表达及功能分析, Expression and Functional Analysis of C1q-like and Mtmr8 in Fish[D]. 水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所. 2009. |
入库方式： OAI收割
来源：水生生物研究所
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