凤眼莲等植物组织和原生质体培养及遗传转化的研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 李学宝 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 1996 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 授予地点 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 导师 | 俞敏娟 ; 刘永定 |
| 关键词 | 植物细胞学 细胞遗传 植物生物化学 植物组织 厚生质体 豆子斗 紫云英 苜蓉 |
| 学位专业 | 水生生物学 |
| 中文摘要 | 凤眼莲植株在低温（2－4 ℃）下培养4－48小时，叶片SOD等多种酶活性减弱，细胞呼吸减慢，酶活性及呼吸减弱程度与低温持续的时间有关。凤眼莲茎段培养在含BA3mg/L的MS培养基础上，可直接分化出芽，分化频率为46.7％。凤眼莲植株必须在高温度条件下培养，这显然与其水生特性有关。绿豆未成熟子叶、紫云英和南苜蓿子和下胚轴培养均获得再生植株。紫云英下胚轴分化频率为62.5％，南苜蓿下胚轴为48.1％，绿豆未成熟子叶为22.5％。从豇豆和绿豆未成熟子叶、紫云英和南苜蓿成熟子叶、凤眼莲叶片和根尖分离原生质体，纯化后的产量豇豆为1.5 - 2 * 10~6/gFW，绿豆为0.5 - 1 * 10~6/gFW，紫云英为1.5 - 2 * 10~6/gFW，南苜蓿为2 - 3 * 10~6/gFW，凤眼莲为0.5 - 1.5 * 10~6/gFW。比较了MS、B_5和KM8P三种原生质体培养基，发现豇豆和凤眼莲原生质体以MS为优，绿豆等则以B_5较佳。豇豆原生质体培养在附加2，4－D 0.2mg/1,BA 0.5mg/l和NAA lmg／l的MS培养基中，10天后的细胞分裂频率可达25.1-32.7％。培养20-30天后，形成肉眼可见的小愈伤组织。凤眼莲、绿豆、紫云英和南苜蓿原生质体也能在15－30天内形成小愈伤组织，其中以南苜蓿原生质体分裂最快，频率最高。豇豆原生质体来源的愈伤组织继代培养在含2，4－D2mg/L，BA0.5mg/L的MSB培养基上，获得胚性愈伤组织。首次从豇豆未成熟子原生质体来源的胚性愈伤组织诱导出大量体细胞胚，进而萌发生长成完整植株。其余几种植物原生质体培养获得根或芽分化。研究了凤眼莲等几种植物细胞遗传转化的条件，建立了农杆菌介导的和PEG介导的基因转移系统。根癌农杆菌经含乙酰丁香酮（AS）等诱导物质以及低pH、低磷酸的培养基诱导培养后，用来感染凤眼莲、紫云英、豇豆和绿豆等原生质体，随后的细胞GUS瞬间表达活性显著提高。这间接证明了上述诱导培养活化了细菌Vir区基因，促进了T－DNA向植物细胞转移。在PEG介导的DNA直接转移中，较高的pH和Ca~(2+)浓度能够提高细胞GUS活性。质粒DNA浓度及启动子类型对外源基因在植物细胞内表达也有一定的影响。首次建立了紫云英等植物的转化系统。采用原生质体－农杆菌共培养法，成功地将外源基因导入凤眼莲、豇豆等细胞中，获得稳定表达gus等外源基因的转化愈伤组织。采用农杆菌感染法，成功地将外源基因导入紫云英、南苜蓿、油菜和芥菜等植物，筛选标记为npt II基因。所用外植体为带有子叶柄的完整子叶或下胚轴切段，与农杆菌共培养2－3天后，转移到含500mg/l头孢霉素（或羧苄青霉素）的杀菌培养基上培养7－10天，启动细胞分裂和分化。然后，再将外植体移入含20-50mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选转化体。把在选择培养基上分化出的茎芽切下，插入生根培养基中，诱导生根。将完整的卡那霉素抗生植株移入盆栽，生长发育至成熟，收获到T_1和T_2代种子。GUS和NPT II酶活性分析表明，外源基因在紫云英等植物细胞内得到稳定表达。用B.t.Cry IA基因或T－DNA左右边界作探针，进行Southern杂交。结果表明，部分抗性植株含有Cry IA基因或T－DNA边界的同源顺序。害虫饲喂试验证明，外源Cry IA基因导入油菜和芥菜获得的转Cry IA基因植物具有明显的抗虫性。在渗透胁迫下，紫云英转proB基因植株叶片游离脯氨酸大量积累，一些转化植株较对照组高2倍，其耐盐能力也有所提高。对油菜转基因植株后代株系所做的遗传分析表明，Km抗性性状遗传符合孟德尔分离规律。部分后代植株PCR试验为阳性，并具杀虫活性，表明Cry IA基因已遗传传递到T_1和T_2代植株基因组中。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-11-16 |
| 页码 | 96 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12500]  |
| 专题 | 水生生物研究所_中科院水生所知识产出（2009年前）_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李学宝. 凤眼莲等植物组织和原生质体培养及遗传转化的研究[D]. 中国科学院水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所. 1996. |
入库方式： OAI收割
来源：水生生物研究所
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