转基因鱼的定点整合研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 汪亚平 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2000 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 授予地点 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 导师 | 朱作言 |
| 关键词 | 转植基因 定点整合 荧光筛选 随机整合 遗传分析 快速生长 基因组靶位 |
| 学位专业 | 遗传学 |
| 中文摘要 | 转植基因(transgene)在受体鱼基因组中以多拷贝串联方式的多位点随机整合，严重制约转基因鱼纯系的快速建立和转植基因的遗传稳定性，是转基因鱼研究亟待解决的问题。转植基因定点整合技术是解决上述问题的重要途径。转植基因定点整合技术，即基因打靶技术，在小鼠基因功能研究中得到广泛应用，并取得重要研究进展。本研究旨在针对鱼类胚胎发育特点，建立鱼类转植基因定点整合技术，以实现转植基因在受体鱼基因组有效靶位的单拷贝定点整合，籍此快速培育转植基因稳定整合的转基因鱼纯系。鱼类植基因定点整合研究包括两个方面，其一是建立定点整合技术，实现转植基因在基因组既定靶位的高效整合；其二是克隆鱼类基因组有效整合位点，为转植基因的定点整合提供基因组靶位。本文就此两方面进行了探索，主要研究内容如下：1.基于鲤鱼β-actin基因顺序，采用长片段PCR技术，克隆了海鲤、大黄鱼的β-actin基因DNA片段，以此作为基因组定点整合靶位。2.根据靶位定点整合正负筛选（PNS）和正向筛选（PS）原理，以EGFP基因为筛选基因，采用启动子缺失方案，设计构建了荧光正向筛选靶位定点整合载体（FPS）。同时构建了药物正负筛选靶位定点整合载体。3.采用组织培养方法，获得鲤鱼和海鲤的尾鳍原代培养细胞，以GFP基因为报道基因，进行了培养细胞DNA电脉冲转染条件优化。4.在鲤鱼培养细胞中进行了转植基因的定点整合研究，采用荧光正向筛选方法，检测到转植基因定点整合的绿色荧光细胞，其出现频率约为10~（-5）；采用药物正负筛选方法，获得抗性细胞克隆，其出现频率为10~（-5）-10~（-6），PCR检测证实，转植基因在基因组靶位实现了定点整合。5.在鲤鱼转基因胚胎中进行了转植基因的定点整合研究，采用荧光正向筛选方法，在转基因胚胎肌肉效应期，部分胚胎中检测到绿色荧光细胞团，绿色荧光细胞嵌合体胚胎的出现频率约为1%（28/2653），PCR检测证实，转植基因在基因组靶位实现了定点整合，PCR检出率约为1‰（2/2653）。6.采用显微注射方法，研制转“全鱼”GH基因黄河鲤鱼，获得快速生长个体。通过与对照黄河鲤鱼杂交，从子代中筛选出快速生长的个体，并对杂交子代转植基因分离进行了遗传分析。结果表明，外源基因在转基因鱼P_o代2-3条染色体上整合，不同整合位点转植基因促生长效应存在差异。本研究首次建立了鱼类转植基因定点整合技术，针对鱼类胚胎发育特点，采用荧光筛选方法，进行鱼类转基因胚胎的转植基因定点整合研究，验证了鱼类转植基因定点整合研究的新思路。在转“全鱼”GH基因鱼的转植基因整合位点研究中，首次应用遗传分析方法，证实转植基因在受体鱼中的多位点整合；通过杂交子代生长数据的统计分析，证实转植基因生物学效应的多样性，同时在转植基因分离的杂交子代中筛选出快速生长个体，为进一步筛选有效整合转植基因，以及基因组有效靶位顺序的克隆奠定了基础。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-11-16 |
| 页码 | 105 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/12566]  |
| 专题 | 水生生物研究所_中科院水生所知识产出（2009年前）_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 汪亚平. 转基因鱼的定点整合研究[D]. 中国科学院水生生物研究所. 中国科学院水生生物研究所. 2000. |
入库方式： OAI收割
来源：水生生物研究所
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