固氮菌突变种DJ35钼铁蛋白和UW3细菌铁蛋白的纯化、特性、晶体生长及鉴定
文献类型：学位论文
| 作者 | 赵剑峰 |
| 答辩日期 | 2004 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院植物研究所 |
| 导师 | 黄巨富 |
| 关键词 | 棕色固氮菌突变种DJ35和UW3 ΔnifE Av1 铬铁蛋白 细菌铁蛋白 纯化和特性 体外激活组装 晶体生长及组成鉴定 |
| 学位专业 | 植物学 |
| 其他题名 | Purification, Characterization, Crystal Growth and Identification of Nitrogenase MoFe Protein from Mutant DJ35 and Bacterioferritin from UW3 of Azotobacter vinelandii |
| 英文摘要 | 一、棕色固氮菌突变种DJ35固氮酶钼铁蛋白的纯化、体外重组及结晶研究 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ35的菌体破碎后，所得的未经加热的粗提物经DEAE Cellulose 52柱层析后得到部分纯的钼铁蛋白（ΔnifE Av1）和铁蛋白(Av2)。部分纯的ΔnifE Av1再经Sephacryl S-300和Q-Sepharose Fast Flow柱层析进一步纯化，便首次得到SDS凝胶电泳检测为基本纯的ΔnifE Av1。SDS-PAGE及Western blotting的结果表明，ΔnifE Av1具有与野生型棕色固氮菌钼铁蛋白(OP Av1)相同的亚基种类和组成（α2β2）。质子还原活性测定表明，在与Av2进行活性互补时ΔnifE Av1不具有明显的质子还原活性，而与从OP Av1抽提出的FeMoco抽提液保温后便可与Av2实现活性互补。这表明，ΔnifE Av1是一种缺失FeMoco的钼铁蛋白。 将ΔnifE Av1用过量的邻菲啰啉(o-phenanthroline)厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，便得到部分丢失Fe的ΔnifE Av1©。在同时存在Av2和MgATP发生系统的条件下，ΔnifE Av1©, 而不是处理前的ΔnifE Av1，可为由KMnO4或Na2CrO4、高柠檬酸铁、Na2S、Na2S2O4 和二硫苏糖醇组成的含Mn或含Cr重组液(RS-Mn或RS-Cr)显著激活，但在缺少MgATP或Av2的条件下，RS-Mn和RS-Cr则不能激活ΔnifE Av1©。这就表明，RS-Mn和RS-Cr对ΔnifE Av1©的激活都需要邻菲啰啉的预处理及Av2和MgATP的同时存在。从分别缺失nifZ和nifB点突变的固氮菌突变种DJ194和UW45中纯化得到的钼铁蛋白，ΔnifZ Av1和NifB- Av1，经邻菲啰啉厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，也分别得到部分丢失Fe的ΔnifZ Av1©和NifB- Av1©。与ΔnifE Av1©一样，这两种蛋白在Av2和MgATP同时存在时也可被RS-Cr和含Mo重组液（RS-Mo）明显激活。 为获得可供X-射线衍射的ΔnifE Av1的大单晶，对组成蛋白质沉淀剂的各种化合物的种类和浓度、缓冲液的pH值、结晶方法及蛋白样品的批次、浓度等结晶条件进行了大量优化研究。首次获得了ΔnifE Av1的深棕色短斜四棱柱晶体，并对其蛋白组成进行了鉴定。 二、铬铁蛋白中残存的棕色固氮菌细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定 从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现，棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDS-和厌氧天然-PAGE皆表明，棕色晶体主要由与Av1类似大小的亚基（~60 kD）组成，而砖红色晶体则主要由~20 kD亚基组成。Western-blotting表明只有~60 kD亚基可与OP Av1的抗体发生反应，而~20 kD亚基则无这种反应。在部分纯的CrFe蛋白中，~20 kD的蛋白含量远低于~60 kD蛋白的含量，表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白中的一种污染蛋白。用3,5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明，形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白。质谱分析表明，该晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白（AvBF）。分辨率为2.34 Å的X-射线衍射结果也表明，砖红色晶体属于H3空间群，晶胞参数为a = 124.965 Å, b= 124.965 Å 和 c = 287.406 Å。首次完成的结构解析也表明，这种砖红色晶体确为24聚体的AvBF。 关键词：棕色固氮菌突变种DJ35和UW3; ΔnifE Av1; 铬铁蛋白; 细菌铁蛋白; 纯化和特性; 体外激活组装; 晶体生长及组成鉴定 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 98 |
| 源URL | [http://ir.ibcas.ac.cn/handle/2S10CLM1/14116]  |
| 专题 | 中科院植物分子生理学重点实验室 |
| 作者单位 | 中国科学院植物研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 赵剑峰. 固氮菌突变种DJ35钼铁蛋白和UW3细菌铁蛋白的纯化、特性、晶体生长及鉴定[D]. 中国科学院植物研究所. 2004. |
入库方式： OAI收割
来源：植物研究所
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