滨海滩涂是海岸带潮间浅滩，是丰富的土地资源，而滨海盐渍化越来越严重，研究耐盐植物-微生物互作及联合修复具有理论和实际意义。茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）ORS571 属于α-变形菌，能够在宿主滨海耐盐植物毛萼田菁（Sesbania rostrata）根部和茎上共生结瘤，也可自生或作为内生菌在其他植物体内固氮。毛萼田菁具有强的耐盐、耐涝能力，常作为滩涂盐碱地土壤改造的先锋植物，在滩涂资源改良利用方面有巨大应用潜力。毛萼田菁也具有较高的经济价值，可用于制作饲料和食品稳定剂等。趋化作用是细菌感受外界化学浓度梯度，向利于自身生长的环境运动的应答过程。在细菌的趋化信号通路中，趋化受体位于起始部分，分为跨膜趋化受体和可溶性趋化受体，跨膜趋化受体主要负责感受胞外信号。本文选取三个茎瘤固氮根瘤菌ORS571 跨膜趋化受体TlpA1、AZC_0719、AZC_1721，对其感应机理进行初步探究，有助于从分子层面阐释茎瘤固氮根瘤菌ORS571 与其宿主毛萼田菁的共生机制。主要的研究内容与结果如下：
利用生物信息学的手段对茎瘤固氮根瘤菌ORS571 趋化受体蛋白质结构域进行分析，发现ORS571 共有43 个趋化受体，其中37 个为跨膜趋化受体。TlpA1位于趋化基因簇前端，具有明显的跨膜区，但其胞外感应结构域尚未知。AZC_0719 具有4HB_MCP 结构域，该结构域普遍存在于原核生物信号转导蛋白中，其两端多伴随跨膜结构域，只感应胞外信号，趋化物类型主要为有机酸类和氨基酸类。AZC_1721 具有CHASE3 结构域，该结构域是位于胞外的感应结构
域，存在于组氨酸激酶、趋化受体中等，主要参与细菌趋化及代谢途径。蛋白质结合位点预测显示TlpA1、AZC_0719、AZC_1721 N 端胞外部分均具有完整的蛋白质结合位点，且三个结合位点预测都与大肠杆菌K12 的组氨酸激酶NarQ 胞外部分同源性最高，NarQ 感应硝酸盐、亚硝酸盐、脂类及碳类等。
本文构建了跨膜趋化受体蛋白TlpA1、AZC_0719、AZC_1721 的N 端表达株，PCR 与基因测序结果显示，表达株构建成功。诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示，表达的目的蛋白为可溶性蛋白。等温滴定量热法（ITC）与蛋白
质热稳定性试验结果显示，TlpA1 与琥珀酸之间存在相互作用，AZC_1721 与3-羟基-2 丁酮之间存在相互作用。
突变株ΔTlpA1 由本实验室提供。本文构建了缺失突变株ΔAZC_0719 和ΔAZC_1721，并对三株突变株进行生长速率、趋化性行为、胞外多糖、生物膜形成、絮凝等表型检测。结果显示，三株突变株与野生型在生长速率方面无显著性
差异。趋化性行为检测结果显示，在碳源为3-羟基-2-丁酮的半固体趋化板上，突变株ΔAZC_1721 的趋化圈显著性大于野生型。在不同碳源的半固体趋化板上，突变株ΔAZC_0719 的趋化圈与野生型无显著性差异。胞外多糖试验结果显示，突变株ΔAZC_0719 和ΔAZC_1721 在刚果红平板上的菌落形态及胞外多糖的分泌与野生型相比无显著性差异。生物膜形成试验结果显示，在外界存在氮源或固氮条件下，三株突变株ΔTlpA1、ΔAZC_0719 和ΔAZC_1721 生物膜形成能力低于野生型。絮凝结果显示，三株突变株ΔTlpA1、ΔAZC_0719、ΔAZC_1721 与野生型无显著性差异。

1.8 本文选题背景及主要研究内容 ................................................................16
1.8.1 选题背景 ..................................................................................................16
1.8.2 选题目的及意义 ......................................................................................16
1.8.3 主要研究内容 ..........................................................................................17
1.8.4 技术路线 ..................................................................................................17
第2 章 茎瘤固氮根瘤菌跨膜趋化受体蛋白TlpA1 功能分析 .....................19
2.1 试验材料 ......................................................................................................19
2.1.1 试验菌株与质粒 ......................................................................................19
2.1.2 试剂与仪器 ..............................................................................................19
2.1.3 培养条件 ..................................................................................................19
2.2 试验方法 ......................................................................................................20
2.2.1 生物信息学分析 ......................................................................................20
2.2.2 茎瘤固氮根瘤菌ORS571 总DNA 提取 ..............................................20
2.2.3 引物设计 ..................................................................................................21
2.2.4 N 端表达载体的构建 ..............................................................................21
2.2.5 N 端表达菌株的构建 ..............................................................................25
2.2.6 原核表达 ...................................................................................................25
2.2.7 蛋白分离与纯化 .......................................................................................26
2.2.8 等温滴定量热法（ITC）试验 ................................................................27
2.2.9 生物膜实验 ...............................................................................................27
2.2.10 絮凝实验 .................................................................................................27
2.3 结果与分析 ...................................................................................................28
2.3.1 TlpA1 蛋白结构域的预测 .....................................................................28
2.3.2 TlpA1 N 端表达菌株的构建 ..................................................................29
2.3.3 原核表达结果 ..........................................................................................29
2.3.4 等温滴定量热法(ITC)试验结果 .............................................................30
2.3.5 生物膜试验结果 ......................................................................................31
2.3.6 絮凝试验结果 ..........................................................................................32
2.4 讨论 ...............................................................................................................33
第3 章 茎瘤固氮根瘤菌跨膜趋化受体蛋白AZC_0719 和AZC_1721
的功能分析 ..........................................................................................................34
3.1 试验材料 .......................................................................................................34
3.1.1 菌株与质粒 ................................................................................................34
3.1.2 试剂与主要仪器 .......................................................................................34
3.2 试验方法 .......................................................................................................35
3.2.1 引物设计 ...................................................................................................35
3.2.2 N 端表达载体的构建 ..............................................................................35
3.2.3 蛋白质热稳定性试验 ..............................................................................35
3.2.4 缺失突变载体构建 ..................................................................................36
3.2.5 缺失突变株ΔAZC_0719/ΔAZC_1721 的构建 .................................36
3.2.6 生长速率的测定 ......................................................................................38
3.2.7 趋化实验 ..................................................................................................38
3.2.8 胞外多糖、生物膜及絮凝能力的观察与测定 ....................................38
3.3 结果与分析 ...................................................................................................38
3.3.1 AZC_0719/AZC_1721 蛋白质结构域分析与结合位点预测 ...........38
3.3.2 AZC_0719、AZC_1721N 端表达菌株的构建 ..................................40
3.3.3 原核表达 ...................................................................................................41
3.3.4 蛋白质热稳定性试验 ..............................................................................41
3.3.5 AZC_0719、AZC_1721 缺失突变株的构建 .....................................43
3.3.6 生长速率测定 ..........................................................................................44
3.3.7 趋化性行为检测结果 ..............................................................................44
3.3.8 胞外多糖的观察结果 ..............................................................................44
3.3.9 生物膜形成与定量分析 ..........................................................................45
3.3.10 絮凝试验结果 ........................................................................................46
3.4 讨论 ..............................................................................................................46
第4 章 全文总结及展望 ...................................................................................49
4.1 全文总结 ......................................................................................................49
4.2 创新点 ..........................................................................................................50
4.3 展望 ..............................................................................................................50
参考文献 .............................................................................................................53
附 录 ....................................................................................................................61