创伤弧菌（Vibrio vulnificus）是一种嗜温、嗜盐、嗜碱的革兰氏阴性海洋致病菌，广泛分布于河口、海洋，可通过皮肤伤口或肠道感染我国主要的养殖鱼类，致病力强、发病迅速且死亡率高，严重危害水产养殖业的发展。创伤弧菌的强致病性直接与其毒力因子相关，目前研究已发现的毒力因子包括溶细胞素、金属蛋白酶、荚膜多糖等。此外，研究发现创伤弧菌可以通过二型分泌系统分泌一种毒力因子磷脂酶VvPlpA，它以磷脂酰胆碱为特异性底物，在致病性中发挥着重要作用。在感染早期，创伤弧菌通过VvPlpA破坏宿主皮肤或肠道的上皮屏障，入侵组织和血管，催化水解产物还可以作为信号分子引发炎症，进而造成组织坏死和败血症。因此，关于创伤弧菌关键毒力因子VvPlpA的研究，对了解其致病机制和防治策略具有重要意义。

通过比对VvPlpA的氨基酸序列发现，它与弧菌属一类胞外磷脂酶序列的相似度都在60%以上，是弧菌共有的热不稳定溶血素（TLH）家族蛋白，而TLH蛋白的分子结构目前均未得到详细的研究和报道；VvPlpA具有SGNH水解酶家族的典型序列特征，根据该序列特征可以确定VvPlpA的活性位点残基包括丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、天冬酰胺（Asn）以及组氨酸（His），其中Ser和His是主要的催化残基，通常协同位于His序列前的天冬氨酸（Asp）或谷氨酸（Glu），以催化三联体的形式发挥水解功能。VvPlpA蛋白在此Asp/ Glu位点的残基为Gly，显示出非经典三联体模式的序列特征。为深入探究TLH蛋白及非经典模式的催化三联体，更好地了解创伤弧菌致病机制与相应防治手段，本研究以创伤弧菌毒力因子VvPlpA为研究对象，通过结构生物学方法探究并分析其结构和功能的关系。

本研究通过大肠杆菌原核表达系统获得硒代甲硫氨酸的VvPlpA重组蛋白，利用单波长反常散射法获取相位信息，解析了目的蛋白VvPlpA的晶体结构。VvPlpA的N端部分包含多个β折叠结构，具体功能目前未知；C端部分具有典型的α/β/α结构特点，属于SGNH水解酶家族的磷脂酶结构域。通过蛋黄平板和血平板定性实验，我们确定了纯化所得VvPlpA重组蛋白的磷脂酶活性和溶血性。为进一步验证VvPlpA中活性位点残基的关键作用，我们设计构建了对应位点的突变体蛋白，其中Ser152Gly， His392Asn及Asn247Asp表现出极低的催化活性，证明了这些活性位点残基在催化功能中十分必要。

在VvPlpA活性位点His392与上述非典型残基的Gly389附近，我们发现了一个较弱的反常散射信号，推测该位置结合氯离子（Cl^-）。我们通过分子置换法解析了在溴离子条件下纯化和结晶的VvPlpA晶体结构，收集对应溴离子（Br^-）的反常散射信号，验证Br^-对Cl^-的取代，由此确定了Cl^-确实结合在VvPlpA蛋白的活性位点附近。我们利用突变体Gly389Asp模拟具有经典催化三联体的蛋白，测定VvPlpA与Gly389Asp在添加不同Cl^-浓度体系中的磷脂酶活性，结果发现野生型蛋白的催化活性伴随Cl^-浓度的升高而上升，直至达到饱和状态下的最大催化速率，Gly389Asp蛋白活性则不随Cl^-的浓度发生改变。由此说明Cl^-在VvPlpA催化功能中起到关键的作用，同时证明VvPlpA磷脂酶具有新颖的Ser-His-chloride催化三联体模式。

为了解经典催化三联体和二联体在VvPlpA中可能的结构模式，我们解析了突变体Gly389Asp与Gly389Asn的晶体结构，其中氯离子的结合位置均被突变残基的侧链所取代，结构特点与催化活性一致。我们还发现突变体Gly389Asn的活性位点附近结合了一个六乙二醇小分子，显示出狭长的底物结合口袋，为探究催化过程中底物的进入和结合提供了重要的结构基础。

第1章 绪论.................................................................................. 1

1.1 创伤弧菌............................................................................................... 1

1.1.1 创伤弧菌概述................................................................................ 1

1.1.2 创伤弧菌的危害和防治................................................................ 1

1.1.3 毒力因子与致病机制.................................................................... 2

1.2 磷脂酶毒力因子................................................................................... 3

1.2.1 细菌磷脂酶及作用机制................................................................ 3

1.2.2 弧菌的热不稳定溶血素................................................................ 5

1.2.3 创伤弧菌磷脂酶VvPlpA.............................................................. 6

1.3 SGNH水解酶超家族............................................................................ 7

1.3.1 SGNH水解酶概述......................................................................... 7

1.3.2 SGNH水解酶催化活性位点......................................................... 8

1.4 活性位点的催化三联体模式............................................................... 8

1.4.1 经典型催化三联体........................................................................ 8

1.4.2 非经典型催化三联体.................................................................... 8

1.5 本研究目的和意义............................................................................. 10

第2章 材料与方法.................................................................... 11

2.1 实验材料............................................................................................. 11

2.1.1 实验菌株与载体.......................................................................... 11

2.1.2 实验仪器...................................................................................... 12

2.1.3 试剂及耗材.................................................................................. 13

2.2 实验方法............................................................................................. 15

2.2.1 重组质粒载体的构建.................................................................. 15

2.2.2 重组蛋白的表达.......................................................................... 20

2.2.3 目的蛋白的纯化.......................................................................... 23

2.2.4 目的蛋白的结晶.......................................................................... 25

2.2.5 衍射数据的收集与处理.............................................................. 27

2.2.6 结构解析与修正.......................................................................... 29

2.2.7 蛋白结构分析.............................................................................. 30

2.2.8 磷脂酶VvPlpA催化活性的测定............................................... 30

第3章 VvPlpA蛋白结构与功能的研究结果和讨论.............. 35

3.1 创伤弧菌VvPlpA的生物信息学分析.............................................. 35

3.1.1 VvPlpA序列信息......................................................................... 35

3.1.2 理化性质分析.............................................................................. 36

3.1.3 二级结构预测分析...................................................................... 37

3.1.4 结构域分析.................................................................................. 38

3.2 VvPlpA蛋白的表达、纯化与活性鉴定............................................ 38

3.2.1蛋白表达与纯化........................................................................... 38

3.2.2目的蛋白的生理活性鉴定........................................................... 40

3.3 蛋白结晶条件的初筛及优化............................................................. 40

3.3.1 VvPlpA和Se-Met-VvPlpA的结晶初筛和优化......................... 40

3.3.2 突变体Gly389Asp、Gly389Asn的结晶初筛和优化............... 43

3.3.3 溴代型蛋白VvPlpA-Br^-的结晶初筛和优化.............................. 45

3.4 晶体结构解析..................................................................................... 47

3.4.1 晶体衍射数据收集与处理.......................................................... 47

3.4.2 结构相位确定与修正.................................................................. 49

3.4.3 结构模型的质量评估.................................................................. 49

3.5 VvPlpA晶体结构与功能分析............................................................ 51

3.5.1 VvPlpA整体结构......................................................................... 51

3.5.2 VvPlpA活性位点结合氯离子的验证......................................... 53

3.5.3 Ser-His-chloride型催化三联体................................................... 57

3.5.4 VvP1pA底物结合区域的结构信息............................................ 62

3.5.5 VvP1pA蛋白的同源结构比对分析............................................ 64

第4章 结论与展望.................................................................... 67

4.1 结论..................................................................................................... 67

4.2 创新点................................................................................................. 68

4.3 展望..................................................................................................... 68

参考文献...................................................................................... 71

致 谢............................................................................................ 77

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果.................. 79