环境污染物的暴露会导致生物体DNA发生修饰或损伤。如果这些损伤未能得到及时、有效地修复，有可能引起疾病（如癌症）的发生。通常发生损伤和修饰碱基的含量都很低（约占整个基因组碱基的0.01 %~ 1 %）， 如何从大量正常碱基中获取痕量碱基修饰产物的结构、序列分布和丰度等信息，是核酸分析面临的严峻挑战，需要高效的酶切技术和高灵敏的检测手段。液相色谱-质谱技术（LC-MS）可从分子结构上阐明核酸修饰类型，提供剂量水平、转化途径等信息，为核酸及其修饰分析提供了有力的研究手段，近年来发展迅速。然而LC-MS在核酸修饰分析方面也面临挑战，如：传统溶液多酶切体系适用于短链核酸片段的酶切，对庞大的基因组DNA酶切效率不高，速度慢（8-12 h）；溶液酶切经历酶灭活、超滤萃取和除盐等过程，周期长、操作繁琐，易引进新碱基修饰（如氧化损伤）或结构转变，增加假阳性风险等。
    本研究提出研制核酸酶切的级联固定化酶反应器，将核酸一步降解为单核苷，具有酶切效率高、速度快、封闭体系干扰小等优势；结合级联酶反应器，发展在线酶切-LC-MS检测碱基修饰或损伤的高灵敏方法，用于细胞和临床样品中核酸损伤标志物的分析。首先，本研究以多孔的毛细管硅胶整体柱为载体，制备了可将分子量达数百万道尔顿的基因组DNA快速酶切为单核苷的超级核酸酶（Bezonase）-蛇毒磷酸二酯酶（SVP）-碱性磷酸酶（ALPase）逐级串联的级联酶反应器。该级联DNA酶反应器具有多孔结构和低背压等特点，通过低压微量注射泵、手推泵等可将DNA样品直接注入酶反应器进行酶解。
    然后，对级联酶反应器的效能进行了表征。结果发现，级联DNA酶反应器将基因组DNA酶解为单核苷，具有高酶切效率（92.0~96.5 %）；酶切速度快（整个酶切时间< 10 min）。相对于传统溶液体系酶切需要8-12小时，本方法显著提高酶切效率和速度。此外，级联DNA酶反应器具有优异的稳定性，可重复使用20次和保存1月以上。经过级联酶反应器酶解后的样品不用热变性或超滤除酶，可直接进入质谱进行目标核苷产物的定性或定量分析；可用于环境污染物暴露下的细胞DNA修饰或损伤分析。
    接着检测了级联酶反应器在实际样品分析中的应用。培养并提取暴露不同剂量的2,3,5,6-四氯-1,4-苯醌（TCBQ）24 h后人膀胱癌细胞T24的基因组DNA，分别通过溶液酶解体系12 h和级联酶反应器酶解10 min，将产物通过HPLC-MS/MS分析，检测其中5羟甲基胞嘧啶（5hmC）的水平变化。结果两种酶解方式所获得的5hmC水平无论从绝对量还是变化趋势上都是一致的，这也证实了酶反应器对实际样品中基因组DNA中痕量损伤和修饰碱基的分析能力。
     本文的创新点在于：经过我们的优化，新制得的级联三酶Benzonase-SVP-ALPase反应器可以实现10 min内基因组DNA的几近全酶解，且经过验证，其对实际样品中基因组DNA的酶解与传统的溶液体系12 h酶解结果一致。这对于更快速的DNA单样品分析无疑是一个极大的推进。借助级联固定化酶反应器，发展与色谱-质谱在线联用技术，可对核酸修饰的结构类型进行鉴定，为阐明药物、环境因素或生物体内源性因素引起的痕量核酸修饰及损伤的分子识别、修复及突变机制提供技术和研究手段。