抗黑色素瘤ScFv-超抗原SEA重组免疫毒素的构建与表达
文献类型：学位论文
| 作者 | 孙静 |
| 答辩日期 | 2003 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 |
| 授予地点 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 |
| 关键词 | 抗黑色素瘤单链抗体 金黄色葡萄球菌肠毒a 融合蛋白 靶向治疗 |
| 学位专业 | 微生物学 |
| 其他题名 | The Construction and Expression of a Recombinant Immunotoxion Named Anti-Melanoma Scfv-Superantigen SEA |
| 英文摘要 | 提取鼠抗人黑色素瘤杂交瘤细胞株HB8759的总RNA，反转录成cDNA，用抗体可变区混合引物扩增出全套重、轻链可变区基因（VH、VLDNA），通过（Gly4Ser）3连接肤基因把VH和VL基因装配成单链抗体（ScFv）基因，将其克隆到噬菌粒载体pCANTABSE中，构建单链抗体噬菌体抗体库。用LIBr黑色素瘤细胞对抗体库进行了3轮亲合筛选。随机挑选克隆进行hage-ELISA鉴定，结果获得了2株具有较高ELISA活性的噬菌体单链抗体。序列测定证实得到的ScFv符合抗体可变区的结构特点，与已发表的鼠抗体可变区基因有较高的同源性。采用酶切连接和重叠PCR连接两种方法将抗黑色素瘤单链抗体基因和去除N端信号肤的金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因进行融合，并将融合基因克隆于pET28-a表达载体的H招标签下游。SDS-PAGE分析表明，两种构建方法均表达了相对分子量约SOkD的蛋白条带，与预期目的蛋白分子量相符，主要以包涵体的形式存在，表达量占菌体蛋白的27％。将重组质粒在大肠杆菌中诱导表达，用盐酸肌溶解包涵体，Ni-NTA鳌合层析柱一步法纯化包涵体，再通过透析使目的蛋白复性。凝胶灰度扫描显示蛋白纯度达90％，凝胶电泳呈单一条带，蛋白量达0.47mg／mL。用健康人外周血单个核细胞作为效应细胞，LDH法检测ScFv-SEA融合蛋白对LiBr黑色素瘤细胞、MCF7乳腺癌的体外抑制率。结果表明该融合蛋白可以通过活化效应细胞，对表达相关抗原的肿瘤细胞产生有效的抗增殖作用，而对不表达该抗原的肿瘤细胞作用不显著。说明该融合蛋白赋予了SEA抗黑色素瘤特异性。以上实验结果为我们研究SEA对黑色素瘤的靶向杀伤作用奠定了可靠的实验基础。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-12-15 |
| 页码 | 101 |
| 源URL | [http://210.72.129.5/handle/321005/3255]  |
| 专题 | 沈阳应用生态研究所_沈阳应用生态研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 孙静. 抗黑色素瘤ScFv-超抗原SEA重组免疫毒素的构建与表达[D]. 中国科学院沈阳应用生态研究所. 中国科学院沈阳应用生态研究所. 2003. |
入库方式： OAI收割
来源：沈阳应用生态研究所
浏览0
下载0
收藏0
其他版本
除非特别说明，本系统中所有内容都受版权保护，并保留所有权利。