Cytorhodin的生物合成研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 桂春 |
| 答辩日期 | 2018 |
| 授予单位 | 南海海洋研究所 |
| 导师 | 鞠建华 |
| 关键词 | cytorhodin，糖基转移酶，还原性脱糖反应，FAD依赖氧化酶，组合生物学 |
| 学位名称 | 博士 |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 其他题名 | Investigation of the Cytorhodin Biosynthesis |
| 英文摘要 | 本研究重点聚焦一株海洋来源替达霉素生产菌Streptomyces sp. SCSIO 1666。该菌株分离自南海北部沉积物，其粗提物具有很强的细胞毒活性。本论文通过传统化学分离手段结合组合生物学技术，充分挖掘其潜力活性分子并阐明其生物合成机制。本研究首先解析了未知功能蛋白TrdC在替达霉素生物合成中的功能。TrdC，SlgL，LipX2，KirHI和FacHI属于一类高度同源但功能未知的蛋白，可能分别参与tirandamycin B，streptolydigin，a-lipomycin，kirromycin和factumycin的生物合成，但其具体功能尚不明确。通过基因敲除实验、回补实验和模拟底物体外酶学实验、点突变实验以及系统发育树分析，我们阐明了该类蛋白是一类新型的Dieckmann环化酶，能够催化2，4-二酮吡咯烷和吡啶环的形成。通过构建替达霉素缺失突变株Streptomyces sp. SCSIO1666/ΔtrdA1DH，从中分离鉴定了一类蒽环糖苷类抗生素cytorhodins X和Y，cosmomycins A和B以及irremycin，同时鉴定了其生物合成基因簇。负责该类化合物生物合成基因簇cyt全长约58 kb，包括51个开放阅读框，由5个聚酮碳骨架合成相关的基因cytE和cyt1-4，3个糖基转移酶基因cytG1，cytG2和cytG3，2个辅助糖基转移酶的基因cytW和cytL，26个编码与蒽环母核形成、氧化还原酶及糖基修饰酶等相关的基因cytA-D、cytF-K、cytM、cytN-S、cytS1-S6、cytU、cytV和cytX，9个编码与调节抗性相关的基因cytR1-R4和cytT1-T5，以及1个未知功能基因cytY构成。Cytorhodins X（1）和Y（2）具有罕见的C-9位糖基化结构。通过基因敲除和喂养实验，研究了三个糖基后修饰基因cytG1，cytG2和cytG3，两个辅助糖基转移酶的基因cytW和cytL在cytorhodin生物合成中的功能。结果表明，CytG1/CytL负责C-7位l-rhodosamine的加载，CytG3/CytW作为一个迭代型糖基转移酶复合物同时负责C-9/C-10位l-rhodosamine的加载。CytG2则同时负责C-7和C-10位三糖链结构中第二个和第三个糖基的加载。终产物1和2，cosmomycins A（3）和B（4）以及irremycin（5）中C-7位脱氧结构的生物合成机制目前尚不明确。通过基因敲除、体外酶学实验研究了硝基还原酶CytA、醛酮还原酶CytC和鸟氨酸环化脱氨酶CytU在cytorhodin生物合成中的功能。实验结果表明，CytA在无氧条件下能够催化C-7位三糖链底物的还原性消除，C-7-OH底物未能观察到反应；CytC在有氧条件下能够高效催化三糖链底物还原性消除反应，同时能够催化C-7-OH底物反应；CytU在有氧条件下能够同时高效催化糖基化底物和羟基化底物。Cosmomycin类化合物三糖链中末端糖中存在差异，推测这种差异是由氧化还原后修饰途径导致的。通过体内基因敲除实验，我们获得了积累末端糖为l-rhodinose的中间体。体外酶学实验表明，氧化酶CytB连续催化含有末端糖l-rhodinose中间体形成含有cinerulose B的终产物。为进一步发掘新的蒽环类化合物，我们利用组合生物学构建了重组菌株Streptomyces sp. SCSIO 1666/17C4。该菌株整合了利迪链霉素来源的包含l-rhodinose生物合成基因及糖基转移酶基因。我们从重组菌株中分离获得了13个新的C7-O-蒽环类化合物。抗肿瘤活性测试结果表明化合物7-4和7-13对人类结直肠癌细胞株HCT-116具有很好的抑制活性，其IC50值分别为0.3 和0.2 μM，与阳性对照表柔比星活性相当。综上所述，本研究发现了一类新型Dieckmann环化酶，鉴定了cytorhodin生物合成基因簇，阐明了部分基因在cytorhodin生物合成中的功能，同时通过组合生物学获取新的衍生物，其结果为揭示cytorhodin完整的生物合成机制奠定了基础。 |
| 源URL | [http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18007]  |
| 专题 | 南海海洋研究所_学位论文（博士） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 桂春. Cytorhodin的生物合成研究[D]. 南海海洋研究所. 2018. |
入库方式： OAI收割
来源：南海海洋研究所
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