希瓦氏菌中两类新颖毒素-抗毒素系统ParE-CopA与HEPN-MNT的功能研究
文献类型:学位论文
作者 | 姚建云 |
答辩日期 | 2018 |
授予单位 | 南海海洋研究所 |
导师 | 王晓雪 |
关键词 | 毒素-抗毒素系统,原噬菌体,HEPN-MNT, mRNA内切酶,融合蛋白 |
学位名称 | 博士 |
学位专业 | 海洋生物学 |
其他题名 | The functional study of two new groups toxin-antitoxin system ParE-CopA and HEPN-MNT in Shewanella |
英文摘要 | 毒素-抗毒素系统广泛分布在原核生物基因组上,在调控微生物的生长代谢,适应不同环境压力方面发挥重要功能。目前关于毒素-抗毒素系统的研究多集中在模式微生物大肠杆菌以及人类病原菌中,对环境微生物基因组上的毒素-抗毒素系统的功能缺乏研究。本论文针对环境微生物希瓦氏菌基因组上两类新颖毒素-抗毒素系统ParE-CopA与HEPN-MNT及其不同存在形式展开研究,重点阐述毒素-抗毒素系统的功能以及发挥作用的分子机制。针对以上研究内容主要取得了以下两部分研究成果:1.原噬菌体上毒素-抗毒素系统ParESO-CopASO的研究。ParESO-CopASO位于希瓦氏模式菌Shewanella oneidensis内的原噬菌体CP4So上,前期我们研究发现原噬菌体CP4So的切离能够增加宿主在低温情况下的存活率。在本研究中,我们利用lacZ报告系统以及PCR的方法对原噬菌体在切离后的稳定性进行检测,发现ParESO/CopASO成对存在能够显著增加原噬菌体CP4So在切离后的稳定性。毒素ParESO具有非常强的细胞毒性,能够引起细胞的丝裂状生长甚至死亡。抗毒素CopASO通过直接的蛋白-蛋白相互作用拮抗毒素毒性同时结合自身启动子上的反向重复序列(GTANTACN3GTANTAC)来抑制自身转录;抗毒素CopASO还通过结合类似的重复序列调控内源性大质粒pMR-1上的另一对毒素-抗毒素系统PemKSO/PemISO的转录。通过对ParESO-CopASO与其他希瓦氏菌基因组上的同源蛋白序列分析发现,ParESO-CopASO存在两种进化形式:以毒素-抗毒素系统的形式存在或以单独抗毒素的形式存在;因此我们对CopASO在希瓦氏菌中的结合序列进行了分析,同时对表达抗毒素CopASO的S.oneidensis菌株测定转录组。利用启动子活性实验以及qRT-PCR的方法验证发现,抗毒素CopASO 的表达能够激活sigma 因子RpoE2 以及其下游基因的表达,增加宿主对氧化胁迫的应对能力;同时CopASO以及它的同源蛋白能够抑制厌氧呼吸关键基因pflA的启动子。上述研究结果不仅说明原噬菌体内部编码的毒素-抗毒素系统不仅能够维持原噬菌体在切离后的稳定性,同时还证实抗毒素能够作为转录调节因子调控胞内多个基因的表达,并且能够通过调控其他毒素-抗毒素系统来介导不同水平转移元件之间的相互作用。2.基因组上毒素-抗毒素系统HEPN-MNT的功能研究。我们前期在S.oneidensis基因组上鉴定了首对HEPN-MNT家族毒素-抗毒素系统SO_3166-SO_3165;然而关于毒素的分子底物以及抗毒素拮抗毒素毒性的机制目前仍不清楚。本研究中,我们合作解析了SO_3166-SO_3165毒素-抗毒素复合物的晶体结构以及在溶液中的构象;发现MNT与HEPN 以2:6的形式形成新颖的八聚体复合物,这种结构在其它毒素-抗毒素系统中非常少见。利用体外酶活实验发现,毒素SO_3166能够特异性的切割mRNA底物而对其他RNA以及DNA分子无切割活性。而抗毒素SO_3165主要是通过它的α2与α4 螺旋与毒素相互作用,同时我们证实抗毒素α2与α4 螺旋结合在毒素的活性位点RX4H基序附近,对于拮抗毒素毒性至关重要。更重要的是,我们在本研究中揭示了抗毒素拮抗毒素毒性的另一种新机制,SO_3165能够作为核苷酸转移酶发挥功能,通过对毒素RX4HDY区域的酪氨酸(Y)位点进行核酸化修饰而起到拮抗毒素毒性的作用。对HEPN-MNT家族蛋白进行生物信息学分析发现,HEPN和MNT除了以II型毒素-抗毒素系统的形式存在,还可以融合成一个基因,不直接翻译出毒素蛋白和抗毒素蛋白,而是翻译出一个同时含有这两个结构域的蛋白。毒素-抗毒素系统在天然状态下的融合蛋白形式目前尚未见报道。在对融合蛋白的研究中发现,融合蛋白中MNT结构域单独存在与抗毒素形式的MNT结构域相比极不稳定,很容易被胞内的蛋白酶Lon水解;而与HEPN结构域融合成一个蛋白后大大增加了其稳定性,对于MNT发挥作用以及拮抗毒素毒性具有重要意义。本研究首次解析了HEPN-MNT家族毒素与抗毒素形成的新颖八聚体结构,并且证实了毒素HEPN通过切割mRNA来发挥作用;此外对抗毒素拮抗毒素毒性的方式研究过程中,揭示了抗毒素能够通过核酸化修饰的方式来拮抗毒素毒性的新机制。 |
源URL | [http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18012] ![]() |
专题 | 南海海洋研究所_学位论文(博士) |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 姚建云. 希瓦氏菌中两类新颖毒素-抗毒素系统ParE-CopA与HEPN-MNT的功能研究[D]. 南海海洋研究所. 2018. |
入库方式: OAI收割
来源:南海海洋研究所
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