酪氨酸电化学检测蛋白质的磷酸化和化学损伤
文献类型：学位论文
| 作者 | 曲娜 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2008-06-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 郭良宏 |
| 关键词 | 酪氨酸电化学 催化氧化 多肽传感器 蛋白质化学损伤 蛋白质磷 酸化 electrochemistry of tyrosine catalyzed oxidation peptide biosensor protein damage protein phosphorylation |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 蛋白质在生命体内行使许多重要的生物功能，可以说没有种类丰富多样的 蛋白，就没有千变万化的生命过程，而这些功能主要取决于蛋白质的结构。一 些小分子变性剂和环境污染物会诱导蛋白空间构象的变化；同样生物体内一些 活性氧类自由基也会导致蛋白质的氧化损伤，从而破坏蛋白质的结构且使其失 活，最终会导致一些疾病的发生。蛋白质磷酸化修饰在细胞诸多生命过程中起 着重要的作用，一些蛋白的异常磷酸化与癌症的形成有直接关系。所以针对蛋 白质的磷酸化和化学损伤与蛋白质生物功能的密切关系，对其建立有效的分析 方法具有重要意义。 本文利用蛋白中酪氨酸的内源电化学活性，结合电化学检测方法的优势， 在实验体系中引入了Os 的金属配合物对酪氨酸的氧化电流进行催化放大，进而 提高了检测的信噪比和灵敏度。在此基础上采用电化学分析方法和传感技术对 蛋白的化学损伤和酪氨酸磷酸化效应分别进行了检测。全文工作共分为三个主 要部分，分述如下： 第一，采用电化学分析方法检测尿素引发的牛血清白蛋白(BSA)的空间构象 变化。本文选择酪氨酸含量丰富的BSA作为模型蛋白，尿素作为小分子变性剂。 当尿素作用于蛋白后，引发蛋白结构发生去折叠现象，使得蛋白内部的酪氨酸 残基暴露在蛋白的表面，最后导致电化学信号发生了改变。在此基础上，考察 了尿素浓度对蛋白空间构象的影响。当尿素浓度达到10M时，蛋白的催化氧化 电流是其自身的三倍，主要是因为蛋白构象的改变使得酪氨酸残基更容易接触 到Os(bpy)2dppz而被催化氧化。为了进一步证明电化学检测结果可靠性，使用已 建立的荧光光谱分析方法同样考察了尿素浓度对蛋白空间构象的影响。实验结 果表明：两种分析方法的检测结果具有很好的相关性，这说明电化学分析方法 检测蛋白的空间构象变化是一种可靠而简便的方法。此外，我们也将蛋白固定 在电极的表面，考察了蛋白的空间构象受尿素的影响，发现其电化学信号变化 趋势与溶液中基本一致，为制备蛋白电化学传感器建立了基础。所建立的分析 方法有望实现对其它非氧化还原蛋白质空间构象的快速且简单的检测分析。第二，构建多肽电化学传感器检测酪氨酸的磷酸化效应。酪氨酸在其苯环 侧链的羟基被磷酸根基团取代而发生磷酸化修饰后，失去了原有的电化学活性， 所以本文利用酪氨酸和磷酸化修饰的酪氨酸的电化学活性的显著差异，采用循 环伏安方法对多肽中的酪氨酸磷酸化效应进行了非标记检测。首先采用静电吸 附层层组装的方法，将分别含有酪氨酸和磷酸化酪氨酸的多肽固定在氧化铟锡 半导体电极的表面，在溶液中Os(bpy)3 2+的催化作用下，检测了酪氨酸磷酸化效 应。实验结果初步表明：所建立的传感器模型可以很好的区分以上两种多肽。 为了进一步证实两种多肽在电极表面的信号差异是由电活性差异导致的，而非 它们在电极表面的吸附量差异所致。本文又采用表面等离子共振的方法，考察 了磷酸化和非磷酸化多肽在传感器表面的吸附量。实验结果发现两种多肽在电 极表面的吸附量相当。这进一步的证明所建立的传感器可以检测酪氨酸磷酸化 效应。此传感器模型有望应用于蛋白酪氨酸激酶 (PTK) 的活性分析和一些药物 小分子对PTK活性抑制的筛选中，对于一些疾病的诊断和治疗具有指导意义。 第三，建立了多肽电化学传感器检测Fenton 反应致多肽的损伤。酪氨酸是 一些活性氧自由基氧化损伤蛋白质过程中攻击的主要氨基酸残基之一，被氧化 的酪氨酸的电化学活性会有所改变。利用酪氨酸的这一特性，检测了由Fenton 反应产生的羟基自由基对传感器表面多肽的损伤。在Fenton 试剂的作用下，电 极表面多肽的电化学信号有显著的下降，这证明多肽被损伤。同时考察了反应 时间和反应浓度与氧化损伤之间的关系，发现Fenton 反应在3 分钟之内可以完 成；而且传感器可以检测体内数量级浓度的Fenton 试剂，说明所构建的传感器 有望实现对体内Fenton 反应的快速、灵敏的检测。另外采用质谱方法表征了酪 氨酸的氧化产物为多巴。以上所建立的传感器可以用来检测其它羟基自由基生 成体系对多肽的损伤，有助于研究一些细胞的损伤效应。 |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-05-27 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/222]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 曲娜. 酪氨酸电化学检测蛋白质的磷酸化和化学损伤[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2008. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
浏览0
下载0
收藏0
其他版本
除非特别说明，本系统中所有内容都受版权保护，并保留所有权利。