核酸荧光探针及纳米核酸适配体荧光探针 用于免疫检测多标记的研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 张勤 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2009-05-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 郭良宏 |
| 关键词 | 多重标记 核酸荧光探针 SiO2 纳米颗粒 核酸适配体 荧光免疫分析 multiple labeling DNA/dye conjugate silica nanoparticle epoxysilane aptamer fluorescent immunoassay |
| 其他题名 | Study and Application of Multiple Labeling of Antibodies with Dye/DNA Conjugates and Double-Functional Dye/Aptamer Conjugates based on silica nanoparticles in the fluorescence immunoassays |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 蛋白质芯片以其高通量，快速，准确及灵敏的检测目标蛋白为优势成为蛋白 质组学研究的重要工具。目前，蛋白质芯片的检测方式多以荧光为信号分子，利 用免疫反应捕获目的蛋白，即在芯片上实现荧光免疫学反应及检测。尽管以荧光 为检测信号的蛋白质芯片已经获得了较高的灵敏度，但随着对低丰度蛋白检测需 求的增长，如何进一步提高蛋白质芯片的检测灵敏度已成为研究者们关注的热 点。本论文通过制备由核酸荧光探针构建的多标记抗体实现了快速，灵敏，低成 本检测靶抗原的目标，并在此基础上以核酸适配体取代双链寡核苷酸，通过制备 核酸适配体/荧光探针复合物检测靶抗原（人α-凝血酶）建立兼具识别与检测双 重功能的荧光免疫检测体系，并以二氧化硅纳米颗粒作为核酸适配体的载体分子 以放大检测信号。该体系有望用于蛋白质芯片检测平台，实现对环境污染物的高 通量筛选检测。 首先，本论文以花菁类染料SYBR Green I 作为荧光核酸探针，利用生物素- 链亲和素这一亲和反应体系作为桥梁，将多个生物素化的核酸与抗体相连，制备 了核酸荧光探针多重标记抗体并将其用于荧光免疫实验检测中。所检测的靶抗原 为小鼠IgG，将其吸附于96 孔板上，通过生物素化的羊抗小鼠IgG 抗体引入链 亲和素，一条30 bp 的双链寡核苷酸通过一端的生物素标记亦固定于微孔板上， 最后加入核酸荧光探针SYBR Green I，通过检测荧光强度的变化实现对靶抗原 的定量分析。建立的这种核酸介导的多标记荧光免疫检测方法与异硫氰酸荧光素 标记的链亲和素介导的免疫荧光实验相比，前者的信号强度提高了近10 倍，同 时检测限亦降低了近10 倍，并且具有良好的特异性。该体系具有实验条件要求 低，载体分子易于获得且结构稳定，荧光染料分子数量可控，标记方法简单易行 等优势。该反应体系有望用于蛋白质芯片检测中，以提高靶蛋白的检测灵敏度， 简化操作步骤，降低实验成本，为蛋白质组学的研究提供有力的工具。 为了进一步简化反应步骤，在体系中引入了核酸适配体。核酸适配体是通过 SELEX 技术体外筛选的短单链寡核苷酸，可特异性识别靶物质。本研究以针对 人α-凝血酶的具有椅型结构的核酸适配体为研究模型，利用核酸适配体在识别人α-凝血酶的同时可与单链核酸荧光探针OliGreen 结合的特点，实现荧光免疫实验 的识别与检测一体化。为了扩增信号，体系中引入了二氧化硅（SiO2）纳米颗粒 作为载体。在免疫实验之前，首先研究了SiO2 纳米颗粒表面功能化及固定蛋白 的条件。本文采用环氧硅烷化试剂3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷 （GPTMS）制备了环氧化SiO2 纳米颗粒，并通过环氧基团直接固定蛋白。采用 反相微乳液法制得平均粒径为46 nm 的SiO2 纳米颗粒，经GPTMS 修饰后，平 均粒径增至63 nm，且环氧化的反应时间，反应温度及GPTMS 的含量对颗粒大 小没有明显影响。修饰后SiO2 纳米颗粒Zeta 电位由－26 mV 变为＋38 mV。经 傅立叶转换红外光谱检测，分别在2944 cm-1，1343 cm-1 和1465 cm-1 处出现碳氢 键的弯曲振动及伸缩振动峰。通过荧光胺与环氧基团共价反应，证明SiO2 纳米 颗粒表面成功修饰了具有反应活性的环氧基团。最后，以荧光素标记的牛血清白 蛋白作为模型蛋白对环氧修饰SiO2 纳米颗粒固定蛋白的能力进行了考查。结果 显示，延长反应时间、增加NaCl 的浓度、降低pH 值以及GPTMS 的含量均可 增加蛋白的固定量，并且形成的蛋白固定的SiO2 纳米颗粒具有高度的稳定性。 通过优化实验条件，每克SiO2 纳米颗粒表面可共价固定大约25 mg 牛血清白蛋 白。 最后，利用制备的SiO2 纳米颗粒固定核酸适配体，获得纳米核酸适配体荧 光探针。首先利用环氧基团共价固定BT-BSA。ATR-FTIR 及TEM 表征证实 BT-BSA 已成功固定于SiO2 纳米颗粒上，荧光法定量计算每克纳米颗粒上固定 BT-BSA 48.7±2.8 mg；通过生物素-链亲和素体系，引入覆盖密度达到1012/cm2 的链亲和素；最后通过生物素将核酸适配体引入纳米颗粒上，可通过调节核酸适 配体的修饰量控制纳米核酸适配体荧光探针的探针数量。通过优化反应条件，筛 选出核酸适配体荧光探针OliGreen，选择0.5 mg/mL 的纳米核酸适配体荧光探针 检测人α-凝血酶，其中单个SiO2 纳米颗粒上标记有约400 条核酸适配体，检测 限为50 nM，检测灵敏度较单个游离核酸适配体荧光探针有所提高，可通过调节 纳米颗粒的粒径改变纳米颗粒表面核酸适配体的修饰密度或增加核酸适配体的 链长来进一步提高检测的灵敏度。 |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-06-04 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/321]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 张勤. 核酸荧光探针及纳米核酸适配体荧光探针 用于免疫检测多标记的研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2009. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
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