稀有鮈鲫卵黄蛋白原纯化和检测方法的建立及其应用
文献类型：学位论文
| 作者 | 骆文茹 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2009-12-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 江桂斌 |
| 关键词 | 稀有鮈鲫 卵黄蛋白原 纯化 多克隆抗体 单克隆抗体 酶联免疫吸附 镉 联合生物效应 Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) Vitellogenin Purification Polyclonal antibody Monoclonal antibody ELISA Cadmium Combined bioeffects |
| 其他题名 | Development and Application of Homologous Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assays in the Determination of Vitellogenin from the Plasma of Chinese Rare Minnow (Gobiocypris rarus) |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 本论文以我国特有的小型鲤科鱼——稀有鮈鲫为实验模型动物，对环境内分 泌干扰物的典型生物标志物——卵黄蛋白原进行了纯化和鉴定，并制备了稀有鮈 鲫卵黄蛋白原的多克隆抗体和单克隆抗体；基于两种抗体建立了两种间接竞争酶 联免疫吸附方法（ELISA）用于定量检测稀有鮈鲫的卵黄蛋白原；在此基础上从 蛋白水平和基因水平研究了环境浓度条件下镉离子和雌二醇对稀有鮈鲫的联合 生物效应。 卵黄蛋白原是一种受雌激素调控的雌性特异性蛋白。正常情况下只有性成熟 的雌性卵生动物体内能够合成卵黄蛋白原，但是雄性动物的肝脏中也存在卵黄蛋 白原基因，在雌激素或类雌激素的诱导下能够合成卵黄蛋白原，并分泌至血液中。 因此，卵黄蛋白原被认为是一种理想的雌激素和类雌激素的生物标志物。另外， 稀有鮈鲫是我国特有的一种小型鲤科鱼，随着对其研究的不断深入，其即将发展 成为水生毒理学研究中的实验模型动物。以稀有鮈鲫为模型动物研究环境雌激素 的生物效应时，其卵黄蛋白原的纯化和检测是进行相关研究的重要基础。 本文应用高效阴离子交换膜色谱，对稀有鮈鲫的卵黄蛋白原进行了纯化。当 流动相流速为3 mL/min 时，纯化工作可在15 分钟之内完成。纯化过程可在室 温下操作，简便、快速，获得的卵黄蛋白原纯度在95%以上。 确定雌二醇对稀有鮈鲫的最佳诱导浓度和时间后，获得了诱导血清，并纯化 了卵黄蛋白原。采用常规免疫学方法制备了稀有鮈鲫卵黄蛋白原兔抗多克隆抗体 和鼠抗单克隆抗体，分别获得了含有抗体的兔抗血清和小鼠腹水，并筛选出5 株 能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株。经免疫印迹法鉴定，所制得的多克隆抗体和 单克隆抗体具有良好的特异性，均只与稀有鮈鲫血清中的卵黄蛋白原特异性结 合，而不与其他蛋白结合。 基于稀有鮈鲫卵黄蛋白原的多克隆抗体和单克隆抗体，建立了两种检测稀有 鮈鲫卵黄蛋白原的间接竞争ELISA 方法。两种方法的检测限均低于3 ng/mL，方 法的标准曲线可覆盖三个数量级。方法的特异性、线性评价都令人满意。基于多克隆抗体和单克隆抗体方法的回收率分别为104.2% 和102.6%，板内和板间变 异系数分别为6.2% 和9.2%，8.6% 和12.8%。两种方法对实际血清样品的检测 结果表明，两种方法具有很好的一致性，都能够灵敏的定量检测稀有鮈鲫血清中 的卵黄蛋白原。同时测定结果表明，稀有鮈鲫对雌激素类化合物的响应比国际上 推荐的模型动物羊头鲦、日本青鳉和斑马鱼更加敏感，表明稀有鮈鲫有可能成为 研究环境雌激素生物效应的理想模型动物。 根据我国水环境调查结果和我国水质标准，设定了与环境浓度相当的雌二醇 浓度和镉离子浓度，开展了二者的联合生物效应研究。实验中固定雌二醇浓度 （10ng/L），并设置不同浓度的Cd2+（0，0.1，1.0，10μg/L），以稀有鮈鲫血清中 卵黄蛋白原的水平以及肝脏中雌激素受体基因、卵黄蛋白原基因、金属硫蛋白基 因和钙结合蛋白基因的表达为检测终点，考察了环境浓度下镉与雌二醇对稀有鮈 鲫的联合生物效应。研究发现，镉离子的存在能够抑制雌二醇诱导的雄性稀有鮈 鲫肝脏中卵黄蛋白原基因的表达和卵黄蛋白原的合成。由于采用低剂量暴露的方 式，两种化合物对雌激素受体基因表达和钙结合蛋白基因表达的影响不显著。暴 露结束时，由于镉离子的作用，金属硫蛋白基因的表达有所上调；但是同时出现 了基因表达随镉离子浓度升高而降低的现象，出现这种现象的原因目前还不得而 知，需要后续的工作进一步研究。 |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2011-03-14 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/541]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 骆文茹. 稀有鮈鲫卵黄蛋白原纯化和检测方法的建立及其应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2009. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
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