毛细管电泳激光诱导荧光偏振分析与E.coli RecA蛋白在单链DNA上的组装过程研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 李涛 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2010-05-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 汪海林 |
| 关键词 | SOS响应 RecA蛋白 协同组装 毛细管电泳激光诱导荧光偏振 金属离子介导的核酸毛细管电泳分析 SOS response RecA protein Cooperative assembly Capillary Electrophoresis coupled with Laser Induced Fluorescence Polarization (CE-LIFP) Metal Cation Mediated Capillary Electrophoresis (MCM-CE) |
| 其他题名 | Capillary Electrophoresis Laser-induced Fluorescence Polarization Analysis and Its application for study of E.coli RecA protein Assembly on Single-Stranded DNA |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 毛细管电泳激光诱导荧光偏振方法在继承了毛细管电泳激光诱导荧光方法的高灵敏、高分辨、快速等分析特点的同时，其对荧光偏振特性的检测使得该方法具备了对分子体积变化的分析能力，从而极大地促进了该方法在蛋白质-DNA相互作用研究方面的应用。本论文以在DNA损伤的SOS响应过程中起到关键作用的RecA蛋白为研究对象，以实验室研制的毛细管电泳激光诱导荧光偏振装置为研究平台，在毛细管电泳相互作用研究方法建立的基础上，以荧光偏振响应作为评价指标，对RecA蛋白在ssDNA上的组装及解离过程进行了考察，并揭示了RecA蛋白在ssDNA上组装和解离过程的特点，以及ATP和单链DNA结合蛋白（SSB蛋白）对RecA蛋白组装过程的调节作用。在对蛋白质-DNA相互作用研究的基础上，本文发展了一种由二价金属离子介导的核酸毛细管电泳分析方法，并将其应用于多种针对DNA或RNA的分离、分析研究领域。 首先利用实验室研制的毛细管电泳激光诱导荧光偏振装置，发展了一种蛋白质-DNA相互作用的研究方法。此部分研究通过将保护性有机渗透剂引入毛细管电泳分离过程，建立了一种有机渗透剂介导的动力学毛细管电泳蛋白质-DNA相互作用分析方法，并将该方法应用于E.coli RecA蛋白和E.coli SSB蛋白与DNA的相互作用研究中。结果表明，丙三醇（甘油）的加入可以有效地保护RecA蛋白的天然构象，增强其与DNA之间的亲和力（约10倍），同时降低解离速率常数（约1/2）。并且，丙三醇对SSB蛋白的构象也具有保护作用，同时这种保护作用不会改变SSB蛋白与DNA相互作用的特异性。该方法不仅可以扩展蛋白质-DNA相互作用的研究范围，使一些亲和力相对较低或稳定性相对较差的蛋白质-DNA相互作用体系可以得到有效的研究，而且可以便于对相互作用体系的动力学或热力学过程进行研究。 在蛋白质-DNA相互作用的毛细管电泳方法建立的基础上，我们开展了RecA蛋白在ssDNA上的组装过程分析。在此部分工作当中，我们采用实验室研制的毛细管电泳激光诱导荧光偏振装置，利用在线荧光偏振分析（FP）评价蛋白质在ssDNA上的组装，并结合毛细管电泳较强的分离能力，考察了在自由溶液体系中RecA蛋白在不同类型ssDNA上的组装和解离过程。在此基础上，初步探讨了RecA-ssDNA-SSB三者之间复杂的相互作用。最后，我们考察了ATP在上述两个相互作用（RecA-ssDNA和RecA-ssDNA-SSB）体系内的生物学动能。结果表明：（1）在ssDNA上组装的过程中，RecA蛋白分子之间存在着与结合在ssDNA上的RecA蛋白数量有关的协同作用，当结合在ssDNA上的RecA蛋白小于8个时，RecA蛋白在ssDNA上组装所形成的核蛋白纤维极不稳定，难以为CE-LIFP所检测；而RecA蛋白数量在8~13之间，核蛋白纤维的稳定性随着RecA蛋白数量的增加而增强；当RecA蛋白的数量在13个以上时，核蛋白纤维可达到一个稳定状态。（2）RecA蛋白在ssDNA上组装所形成的核蛋白纤维具有微弱的不均一性，这种不均一性来自于核蛋白纤维末端的RecA蛋白解离。（3）ssDNA的折叠结构对RecA蛋白在其上组装的成核过程具有明显的阻碍作用，但一旦完成组装，RecA蛋白在不同折叠结构的ssDNA上组装所形成的核蛋白纤维具有相似的组装度，显示了RecA蛋白对ssDNA折叠结构的展开作用。（4）ATP的存在可以显著降低RecA与ssDNA结合的亲和力，并调节RecA蛋白在ssDNA上的组装，这种调节作用使得低浓度条件下的RecA蛋白无法组装在ssDNA上，从而揭示了未损伤细胞中大量存在的RecA蛋白无法引起SOS响应的原因。（5）SSB蛋白与RecA蛋白之间存在着竞争结合ssDNA的关系，这种竞争作用与SSB蛋白的浓度存在着密切的关系。 在前面的实验过程中，我们发现了一些意想不到的实验现象——当毛细管电泳分离体系中存在Mg2+时，不同ssDNA之间会表现出不同的迁移速率。随即我们开展了本文的第三部分工作。此部分工作中将二价金属离子（Mg2+或Ca2+）引入毛细管电泳分离缓冲溶液中，建立了一种金属离子介导的核酸毛细管电泳方法（MCM-CE），并将其应用于不同类型DNA片段的分离分析研究中。实验结果表明，在二价金属离子存在的情况下，不同类型的DNA片段，包括不同长度、相同长度不同二级构象或相同长度相同二级构象但不同碱基堆积程度的DNA片段，由于其与二价金属离子之间的非特异性相互作用的差异，可以在MCM-CE方法下得到有效地分离，显示了该方法的通用性。在成功地证实了MCM-CE方法在DNA分离分析有效性的基础上，我们将其应用于DNA杂交分析、microRNA构象分析、aptamer构象分析、酶解产物分析以及DNA加合物分析等多个领域，均得到了令人满意的实验结果。可以预见随着MCM-CE方法的发展，其在临床DNA诊断工作中具有广阔的应用前景。 |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 语种 | 英语 |
| 公开日期 | 2011-08-19 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/653]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李涛. 毛细管电泳激光诱导荧光偏振分析与E.coli RecA蛋白在单链DNA上的组装过程研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2010. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
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