荧光细菌DNA损伤检测传感器的构建及其应用
文献类型：学位论文
| 作者 | 陈芝兰 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2011-05-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 汪海林 |
| 关键词 | DNA损伤试剂 荧光细菌传感器 SOS反应 recA基因 增强型绿色荧光蛋白EGFP DNA damaging agents Fluorescent bacterial biosensor SOS response recA gene Enhanced green fluorescence protein. |
| 其他题名 | Construction of Fluorescent Bacterial Biosensors and Their Applications for Detection of DNA Damaging Agents |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 环境中存在各种对人体有害的污染物，常以低剂量和长期暴露的形式作用于人体。由于污染物的种类很多，人们需要这些化合物的毒理学数据，以理解相应的毒性作用机制和健康效应，发展合适的预防和控制措施。目前的毒性检测方法在解决特定问题的同时还存在一定的缺点，迫切需要建立快速、简便、高通量、广谱的筛选与鉴定手段，以实现对数目众多的化学品进行毒性评估。DNA损伤是一种极其重要的毒理作用，是诱发基因突变、癌症发生和发育畸形的关键因素。许多环境污染物可引起生物体内DNA的损伤。因此，发展DNA损伤试剂的筛选和分析的方法和手段对环境毒理学以及生态风险评价具有十分重要的意义。细菌学检测DNA损伤试剂的方法具有灵敏、快速、简便、高通量以及可以实现在线、实时检测等特点，预期在环境中DNA损伤试剂的筛选、检测与鉴定方面应有十分广泛的应用。 本文构建了一种由在SOS反应中起关键作用的recA基因启动子调控表达增强型绿色荧光蛋白基因的质粒，筛选并鉴定出合适的大肠杆菌细胞，将质粒转化入细胞，并利用这些细菌细胞对DNA损伤试剂进行检测与筛选。全文共分六个章节，主要内容为： 第一章 介绍了生物体细胞内DNA损伤的性质与类型，以及各种检测方法，包括化学方法，化学-生物学结合的方法以及生物学方法。着重介绍了生物传感器对DNA损伤试剂的检测方法，包括高等生物传感器法以及细菌细胞传感器法（致突变检测Ames法，WP2法和lacZ回复突变法，以及启动子-报告因子法）。 第二章 利用基因工程的方法将水母来源的、光谱优化与折叠效率优化的egfp基因克隆出来，并将其构建于pET-16b质粒载体中，转化蛋白表达型菌株BL21(DE3)菌株。经过乳糖类似物IPTG的诱导，可产生明亮绿色荧光，说明该融合蛋白能在大肠杆菌细胞中形成天然构象并具有正确的蛋白功能。然后将SOS反应中的关键基因recA基因的启动子克隆出来，并将egfp基因克隆至该启动子的下游，构建了pETPrecAegfp5质粒，经PCR扩增和测序分析验证获得了具有与模板DNA序列和方向一致的recA启动子和egfp基因插入片段。该质粒随后转化两种大肠杆菌菌株，并筛选得到了对DNA损伤试剂响应强的B5菌株。结果表明，通过基因工程手段获得的具有在recA启动子控制下的egfp基因的质粒载体pETPrecAegfp5能够对DNA损伤产生响应，并编码具有正确构象与功能的EGFP蛋白。 第三章 将第二章中成功构建的pETPrecAegfp5质粒转化BL21(DE3)菌株，得到的B5菌株对几类不同DNA损伤试剂均具有明显的响应，说明B5菌株在大规模的筛选与检测环境中DNA损伤试剂和抗癌药物等方面具有较大的潜力。同时通过区分B5菌株对不同化合物的DNA损伤能力和细胞毒性的响应，可以分辨出被测试化合物是否属于DNA损伤试剂。与已报道的同类型细菌传感器相比，B5菌株对DNA损伤能力的检测灵敏度有所提高，并且可同时测定被测化合物的细胞毒性。与经典的Ames法相比，利用B5菌株的SOS-EGFP检测法具有一定的优势。由B5菌株产生的EGFP蛋白的荧光信号可以利用多种仪器进行检测，大大方便了研究过程，同时可以获得更多的关于B5菌株暴露于被测化合物的毒性作用的信息。 第四章 我们进一步构建了可灵敏检测DNA氧化损伤试剂的荧光细菌传感器L5菌株。通过抗氧化酶基因（两个过氧化氢酶基因katG和katE基因，以及烷基过氧化物还原酶基因ahpCF基因）的敲除，L5菌株对一些氧化损伤试剂的检测比同类细菌传感器的检测限低10～20倍，并且能够检测到更多的DNA损伤试剂。例如，L5菌株对五氯酚PCP及其代谢中间体氯代儿茶酚具有强烈的响应，而B5菌株对这些化合物却没有响应。L5菌株同时对醛类、对苯醌类化合物以及喹诺酮类抗生素的检测显示呈阳性，这说明L5菌株具有广谱检测的特点。L5菌株抗氧化基因的敲除使其可检测更多的DNA损伤试剂，显示更宽的检测范围，而且更加灵敏，更加准确。同时由于微生物细胞生长快，培养成本低，检测方法操作简单，迅速（通常小于2个小时），而且具有高通量检测的特点，这就使得L5菌株检测法比基于哺乳动物细胞的检测方法具有特定的优势。 第五章 对L5菌株灵敏响应氧化损伤试剂可能的机制进行了初步探讨。研究表明，L5菌株的响应是不依赖于细胞内的还原性物质谷胱甘肽。目前并不清楚L5的响应是否与细胞内的铁离子相关。另外证明了厌氧表达的EGFP蛋白的荧光产生需要氧化的过程。在L5菌株产生响应的过程中，不同类型的DNA损伤试剂很可能通过不同的途径对L5菌株细胞的DNA进行了损伤作用。 第六章 总结了本文中构建的检测DNA损伤试剂的细菌传感器及发展的筛选和检测方法，并对其今后的应用前景进行了展望。本研究中构建的L5菌株和B5菌株所构成的SOS-EGFP荧光细菌传感器检测法，可望应用于检测医院废弃物，工业废水，农业污染以及核工业污染等等领域的环境致癌物，是一种非常有前途的检测方法。 |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2011-08-26 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/711]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 陈芝兰. 荧光细菌DNA损伤检测传感器的构建及其应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2011. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
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