纤维素热解产物1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖生物转化研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 庄绪亮 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2001-02-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 张洪勋 |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 通过热解纤维素获得1，6一脱水．D．D．吡喃葡萄糖(LevoglUOCSan，简称LG)。在单因子实验得到各影响因素(Xl， 温度：X2，升温时间；X3， 真空度)中心点的基础上，采用Box-Behnken设计及响应面分析方法对热解条件进行了优化。各影响 因子与LG 产率之间 的回归方程为 ：Y=21．08+3．91X，一1．14X2+5．73X。一5．3X,。一3．72X：。。将真空度固定为1mmHg，得到最佳热解温度和升温时间分别为388℃和26．2分钟。LG得率实验值与方程预测 值有较好的拟合。TLC和HPLC检测证明LG为热解液中的主要产物。 LG通过两种方法进行分离：乙酸乙酯萃取法和阴离子交换树脂法。乙酸乙酯萃取法包括： 热解液中加入水和氢氧化钙后将pH值调至12一13，继续加入1．5—2倍氢氧化钙0．25—0．5倍活性炭以吸附热解液中的色素等杂质；将上述混合液用4一甲基一2一戊酮共煮沸，蒸去水分，得到固体颗粒物；固体烘干后磨成粉末用乙酸乙酯连续萃取，蒸去萃取液中的溶剂后可得到LG结晶。阴离子交换 树脂法包括：热解液中的液相和固相分别处理；液相加入水去除木素后用活性炭柱处理；洗脱液浓缩后再用阴离子交换树脂处理；洗脱液在适当温度下保温3小时； 去除沉淀后同除去木素后的固相所得溶液混合后减压蒸发，再加入丙酮结晶。 出发菌株黑曲霉CBX一2经Y一射线诱变后筛选到突变株CBX一209。同出发菌株相比，在以LG为唯一碳源的液体发酵培养基中，突变株在形态学上发生明显变化， 前者菌丝体分枝较少且相互连接松散，后者菌丝紧紧缠绕在一起形成致密的菌丝球。利用黑曲霉CBX一209将LG发酵为柠檬酸。实验证明，柠檬酸产率随LG纯度的提高而增大。在葡萄糖培养基中，黑曲霉CBX一209同出发菌株相比，柠檬酸产率有所降低：CBX一2为101％，CBX一209为92．5％，但CBX一209在LG培养基中的柠檬酸产率却有大幅度提高：从5．63％提高到87．5％。发酵过程中，LG为该菌株的唯一碳源和能源，发酵周期为5天。 利用葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶复合系统测定证明该突变菌株不存在l，6一缩水一D—D一吡哺葡萄糖水解酶。在HPLC测定结果的基础上采用快原子轰击质谱技术结合6一磷酸葡萄糖脱氢酶系统进行测定，结果表明经(NH。)：S0。沉淀或阴离子交换层析处理后的无细胞提取液在加入ATP和Mg扑的条件下能直接催化1，6一缩水一D—D一吡喃葡萄糖合成6一磷酸葡萄糖，证明黑曲霉突变株中存在1，6一缩水一D—D一吡哺葡萄糖激酶。该酶为诱导酶。 对该酶进行了部分分离纯化并对 部分酶学性质进行了研究。该酶在pH6—10的范围内都比较稳定，酶反应中最适pH为9．3。温度超过20℃后酶开始有较大的活性丧失，反应中最适温度为30℃。双倒数作图法得到酶对底物LG和ATP的Km值分别为71．2 rrN和0．25mlVl。该酶作用于底物LG有高度专一性，发现反应产物ADP对其有一定的抑制作用。 将在LG上生长并产柠檬酸的黑曲霉CBX一209的cDNA文库全部质粒转化不能利用LG生长的大肠杆菌DH5 a，在大肠杆菌DH5 Q中构建了黑曲霉CBX一209的cDNA表达文库。在以LG作为唯一碳源和能源的选择性合成NCE培养基上筛选到3个阳性重组子。重组子能在以LG为唯一碳源的培养基上生长，聚丙烯酰胺凝胶电泳活性染色法证明筛选到的重组子能表达LG激酶活. |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 公开日期 | 2011-11-03 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/1394]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_中国科学院环境生物技术重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 庄绪亮. 纤维素热解产物1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖生物转化研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2001. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
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