本发明属于基因工程领域，涉及一种表面展示目的蛋白或酶的萌发缺陷和无抗生素抗性基因的重组芽孢制备方法。该方法包括构建含枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白与目的蛋白或酶融合表达的重组基因、两侧有枯草芽孢杆菌位点特异的重组酶Xer识别和切割序列的抗生素抗性基因、以及以控制芽孢萌发的关键基因为整合片段的重组载体；重组载体转化枯草芽孢杆菌，通过同源重组和切除重组，分别将重组基因整合于染色体控制芽孢萌发基因中并剔除抗生素抗性基因，获得萌发缺陷、无抗生素抗性基因且表面展示目的蛋白或酶的重组芽孢。本发明具有安全和高效的优点，可用于制备以枯草芽孢杆菌芽孢为载体的动物口服重组芽孢疫苗、特异污染物降解酶或动物饲料添加酶等。