本发明公开了用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对，所述引物对包括上游引物hlyB‑III‑F 和下游引物hlyB‑III‑R，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明还公开了迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法。本发明还公开了一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒。本发明还公开了迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。本发明还公开了迟缓爱德华氏菌的检测方法。用本发明的方法可以快速准确地检测无鳞鱼体内或养殖水体是否含有致病菌，做到有针对性的防治鱼病。