核糖体失活蛋白的结构生物学研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 侯晓敏 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2008-06-06 |
| 授予单位 | 中国科学院福建物质结构研究所 |
| 授予地点 | 福建物质结构研究所 |
| 导师 | 黄明东 |
| 关键词 | 核糖体失活蛋白（RIPs） 晶体结构 X-ray序列 DNA测序 细胞毒性 |
| 其他题名 | Structural study of ribosome-inactivating proteins |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 中文摘要 | 本论文主要包括两个部分的内容，第一部分是关于几种1型核糖体失活蛋白（八棱丝瓜蛋白1、南瓜蛋白、β、γ-天花粉蛋白）的结构生物学研究，第二部分初步地研究了整合素αMβ2 I-domain。 植物核糖体失活蛋白（RIPs）具有rRNA N-糖苷酶活性，能够抑制蛋白质的生物合成。它们具有多种生物功能，如抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、诱导细胞凋亡、免疫抑制和抑制HIV整合酶等，这些发现激发了人们的研究兴趣。另外，核糖体失活蛋白在农业和生物医学研究中也具有重要的应用价值，如培育转基因农作物、研制免疫毒素等。因此核糖体失活蛋白已逐渐成为一个研究热点。 蛋白质的氨基酸顺序可以通过Edman降解、质谱法和cDNA测序获得，从高分辨率的晶体结构也可以获得蛋白质氨基酸序列的信息，但是在辨别Asp/Asn，Glu/Gln和Val/Thr氨基酸对时存在不可避免的困难。八棱丝瓜蛋白1是来源于八棱丝瓜种子的一种新型的核糖体失活蛋白，它除了具有rRNA N-糖苷酶活性外还可以诱导肿瘤细胞的凋亡和分化，从而抑制肿瘤细胞的增殖。八棱丝瓜蛋白1的晶体结构可以衍射到1.4 Å的分辨率，它的氨基酸顺序就是基于以下标准从高分辨率的晶体结构中推测的：1）高分辨率的晶体结构；2）不对称单元中两个分子的电子云密度图的比较；3）对某些难以区分的氨基酸对（Glu/Gln，Asp/Asn和Val/Thr）的化学环境的评估；4）与同源蛋白氨基酸顺序的比较。通过标准1和2，可以推断出66％的氨基酸顺序；再加上标准3，则可有86％的氨基酸顺序被推断出来，这也表明对某些氨基酸的化学环境的评估，对推断一些难以分辨的氨基酸对具有一定的有效性。总之，通过这4个标准利用X-射线测序的方法，能推断出94％的八棱丝瓜蛋白1的氨基酸顺序。从八棱丝瓜嫩叶中提取基因组DNA，以八棱丝瓜蛋白1的X-ray序列为基础，设计上下游引物，进行PCR扩增，从而测定八棱丝瓜蛋白1的氨基酸序列。通过比较八棱丝瓜蛋白1的X-ray顺序和用DNA方法测定的氨基酸顺序，证明超过90％的X-ray序列是正确的。在八棱丝瓜蛋白1的晶体结构中有两个N-乙酰基葡萄糖分别连接在77位和84位天冬酰胺上。Tyr70，Tyr110，Glu159和Arg162是八棱丝瓜蛋白1的活性位点。 南瓜蛋白是从南瓜瓜瓤（Cucurbita moschata）中提取的一种新型核糖体失活蛋白。除了具有rRNA N-糖苷酶活性外，南瓜蛋白还对鼠源和人源的三种癌细胞产生细胞毒性，但是对正常细胞的毒性较小。从南瓜的嫩叶中提取植物基因组DNA，基于N-端氨基酸顺序和C-端X-ray序列设计上下游引物，进行PCR扩增。南瓜蛋白全长的氨基酸顺序是通过N-端Edman降解，部分DNA测序获得，同时经高分辨率的晶体结构验证分析。南瓜蛋白的晶体结构可以衍射到1.04Å，目前还没有其它RIPs的晶体结构达到这样的分辨率。南瓜蛋白的晶体结构包含两个结构域：一个大的N-端结构域，由七个α-螺旋和八个β-折叠组成；一个小的C-端结构域，由三个α-螺旋和两个β-折叠构成。基于南瓜蛋白高分辨率的晶体结构，可以构建一个混合型寡糖链的模型GlcNAc2Man3Xyl，其中Asn225为糖基化位点。氨基酸Tyr70,，Tyr109,，Glu158 和Arg161为南瓜蛋白的活性位点。 采用两步阳离子交换树脂洗脱技术，可以从葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）块根中，快速分离出α、β、γ-天花粉蛋白，α-天花粉蛋白就是先前报道的天花粉蛋白。纯化过的α、β、γ-天花粉蛋白用EMI-MS测定分子量分别为27167，27143和27262 Da。β-天花粉蛋白分别以氯化钾和聚乙二醇为沉淀剂均可长出单晶。前者（晶型A）在同步辐射光源上收集到一套1.6Å数据，晶体属于正交晶系P212121空间群，后者（晶型B）在同步辐射光源上收集到一套1.2 Å数据，晶体属于单斜晶系P21空间群。目前β-天花粉蛋白两种晶型的模型构建和结构修正工作正在进行。γ-天花粉蛋白以硫酸铵为沉淀剂可以长出单晶，它在同步辐射光源上可以收集到一套2.2 Å数据，晶体属于六方晶系P622空间群，目前蛋白晶体的结构解析工作正在进行中。 αMβ2是整合素家族中的一员，是介导细胞和细胞外基质以及细胞间粘附作用的主要因子，可以识别、结合细胞外基质中相应的配体，为细胞黏附提供附着点。这些蛋白一般都是由α、β两条链经非共价键连接组成的异源二聚体。在α链的N末端包含了200个左右的氨基酸，被称为“I-domain”，它在识别许多蛋白配体以及非蛋白配体中起到关键作用，也是识别金属离子的主要位点。大量的、均一性好的蛋白对I-domain和其配体的结构研究是相当重要的。为了增加重组蛋白表达产量，可以对基因进行重新设计合成。本文借助DNAWorks在线程序，采用基因拼装法，合成了适合大肠杆菌表达菌株所偏爱的模板，提高了αMβ2 I-domain在大肠杆菌的表达量。另外我们采用不同咪唑浓度阶段洗脱的方法，简化了纯化步骤，使其只经过一步Ni柱纯化就能得到纯度达到90％的蛋白。由电喷雾质谱（ESI-MS）法测定出纯化蛋白的肽指纹图谱（PMF），经Mascort程序分析鉴定了目的蛋白。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-05-09 |
| 页码 | 105 |
| 源URL | [http://ir.fjirsm.ac.cn/handle/350002/7512]  |
| 专题 | 福建物质结构研究所_中科院福建物质结构研究所_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 侯晓敏. 核糖体失活蛋白的结构生物学研究[D]. 福建物质结构研究所. 中国科学院福建物质结构研究所. 2008. |
入库方式： OAI收割
来源：福建物质结构研究所
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