人血清白蛋白与溶血磷脂相互作用的结构研究 以及 Endo180 D1-D3突变体的克隆与表达
文献类型：学位论文
| 作者 | 郭世辉 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2008-06-06 |
| 授予单位 | 中国科学院福建物质结构研究所 |
| 授予地点 | 福建物质结构研究所 |
| 导师 | 黄明东 |
| 关键词 | 人血清白蛋白 磷脂 溶血磷脂 溶血磷脂酰乙醇胺 荧光光谱 X射线晶体学结构 Sudlow site 1 相互作用 结合位点 甘露糖受体 尿激酶纤溶酶原激活物受体相关蛋白 Endo180 FNII 胶原蛋白 表达载体构建 毕赤酵母X-33 蝇S2 |
| 其他题名 | Structural Basis of Transport of Lysophospholipids by Human Serum Albumin and The Clone and Expression of Endo 180 D1-D3 |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 中文摘要 | 1.溶血磷脂（Lysophospholipid）是一类仅含有一条脂肪酸链的甘油磷脂，不仅是质膜磷脂的水解产物，也是生物膜合成的原料。最近研究发现，溶血磷脂在细胞信号传导中起着重要的角色，并参与许多的生理过程（比如：肿瘤发生，发展，免疫，动脉硬化和癌症等）。高浓度的溶血磷脂具有潜在的细胞毒性，而且经常伴随着一些病症（比如动脉粥样硬化、心肌缺血等）。由于溶血磷脂可以不断的从质膜磷脂上水解释放和它对细胞的潜在毒性，预示着正常人体中存在着某种机制确保溶血磷脂的低含量,以保证各种细胞的正常生理功能。在胞内，溶血磷脂的转运主要靠磷脂结合蛋白；细胞外，同样发现有溶血磷脂的存在。然而，人们对它的运输机制还不清楚。本研究综合结合荧光光谱和X射线衍射技术，详细探讨了一溶血磷脂（溶血磷脂酰乙醇胺）与人血清白蛋白（人体血液中含量最丰富的血浆蛋白）的相互作用。荧光光谱的实验结果表明，一个白蛋白分子能够结合一分子的溶血磷脂酰乙醇胺，亲和力约为1.6μM。在此基础上，我们结晶了人血清白蛋白与溶血磷脂酰乙醇胺复合物晶体，通过X射线衍射，成功解析了晶体结构。结果显示，溶血磷脂酰乙醇胺结合在人血清白蛋白的IIA区Sudlow site1（人血清白蛋白上最主要的两个药物结合位点之一）。最近研究发现，Sudlow site1可以进一步细分为三个亚结合位点（FA7 site; SAL site; IMN site）。溶血磷脂酰乙醇胺同时占用了其中两个结合位点（FA7 site; SAL site），其中蔬水的脂肪酸链位于Sudlow site1底部，极性头部则在Sudlow site1的溶液入口处。这种巧妙的安排方式使得人血清白蛋白能够结合其他的溶血磷脂（比如溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰丝氨酸）。尽管IMN site有足够的空间可以容纳下一脂肪酸链，但考虑到人血清白蛋白IMN site具很强亲水性，我们认为人血清白蛋白可能无法结合含两条脂肪酸链的磷脂。本项研究首次为溶血磷脂与人血清白蛋白的相互作用提供了详细的结构信息，使人们对溶血磷脂在胞外运输和分布有了更加清晰的理解。 2.Endo180，又称为尿激酶纤溶酶原激活物受体相关蛋白（uPARAP），是甘露糖受体家族的一个成员。Endo180通过与胶原蛋白、尿激酶型纤溶酶原激活物受体相互作用，参与了胞外基质的重塑过程，从而参与肿瘤的黏附和迁移。Endo180的胞外结构，主要由富含半胱氨酸区域、单个Ⅱ型纤维连接蛋白(FNⅡ)区域、8个凝集素样区域(CTLDs)组成。其中，FNⅡ区域是结合胶原蛋白的区域，可与胶原蛋白V、I和Ⅳ结合。但是，单独存在的FNⅡ并不能与胶原蛋白结合，推测可能是单独存在的FNⅡ结构不稳定性或不能形成正确的构象。研究显示，FNII仅加上其前半胱氨酸区域同样不具备胶原蛋白结合能力，而同时加上其前后两个结构域的Endo180 D1-D3结构域则具有胶原蛋白结合功能。本项研究中，我们应用分子生物学手段突变了Endo180 D1-D3结构域中两个潜在的糖基化位点(N69Q;N140Q)，以获得均一的，适合晶体生长的蛋白。首先，我们将突变基因片段与pPICZαA连接，构建适用于酵母细胞（Pichia pastoris X33）的表达载体pPICZαA - Endo180 D1-D3，诱导表达、纯化获得重组蛋白。但由于重组蛋白在酵母细胞的表达量低，不足以用于后续的结构生物学研究，我们将目光转向真核细胞表达系统。将突变基因片段与pMT/Bip/v5-his C连接，我们构建适用于果蝇细胞（Drosophila S2）的表达载体pMT/V5/His C- Endo180 D1-D3。在此基础上，我们加入了suPAR-D3以期提高重组蛋白的表达量。这些工作为下一步研究Endo180与其配体的相互作用，研究尿激酶型纤溶酶原激活系统的调控机制，揭示Endo180的作用机理都具有十分重要的意义。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-05-09 |
| 页码 | 89 |
| 源URL | [http://ir.fjirsm.ac.cn/handle/350002/7560]  |
| 专题 | 福建物质结构研究所_中科院福建物质结构研究所_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 郭世辉. 人血清白蛋白与溶血磷脂相互作用的结构研究 以及 Endo180 D1-D3突变体的克隆与表达[D]. 福建物质结构研究所. 中国科学院福建物质结构研究所. 2008. |
入库方式： OAI收割
来源：福建物质结构研究所
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