组织型纤溶酶原激活物突变体在毕氏酵母中表达、纯化及生物学研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 曾途 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2008-06-06 |
| 授予单位 | 中国科学院福建物质结构研究所 |
| 授予地点 | 福建物质结构研究所 |
| 导师 | 黄明东 |
| 关键词 | tPA Pichia pastoris 纤溶酶原 重叠延伸PCR MALDI-TOF-MS |
| 其他题名 | Expression, purification and characterizaton of tissue-type plasminogen activator mutants |
| 学位专业 | 材料物理与化学 |
| 中文摘要 | 丝氨酸蛋白酶的激活过程多年来一直是研究的热点。利用X射线晶体学方法，通过对胰凝乳蛋白酶与胰凝乳蛋白酶原的催化结构域进行对比，可以发现胰凝乳蛋白酶原的一个肽键被水解断裂后，该丝氨酸水解酶就成为双链蛋白，暴露出其催化结构域（又称SPD区: Serine proteinase domain）的N端。这N端通过与Asp194 （Chymotrypsin numbering）形成盐桥稳定了其催化口袋区，进而激活丝氨酸蛋白酶使其具有生物催化活性。 进行蛋白质三维结构的研究需要大量高纯度的蛋白，目前大部分使用重组蛋白以满足科研需求。重组丝氨酸水解酶的制备一般需要两个步骤：第一，制备大量的丝氨酸蛋白酶原；第二，使用特异性的水解酶进行该丝氨酸蛋白酶原的激活。本项研究旨在将上述两个步骤简化为一个步骤。我们知道在毕氏酵母表达系统中pPICZA质粒的-factor信号肽在蛋白分泌到胞外的过程中会被位于毕氏酵母高尔基体上的Kex2酶清除，如果能将目的蛋白的基因克隆于表达质粒的序列中，并在Kex2酶切位点之后，我们就可以表达具有游离N端的蛋白。通过上述方法在毕氏酵母表达系统中表达具有天然N端的丝氨酸蛋白酶P区的突变体，就可以将丝氨酸蛋白的表达与激活过程简化为一步。目前，我们利用这个方法已成功地表达了两种具有重要生理、药理学意义的组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator, tPA)突变体。 组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是临床上治疗急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）的主要药物。近年来，人们从研究tPA的结构入手，以构效关系为原则，利用DNA重组及蛋白质工程技术构建了一系列tPA变异体，它们在延长其体内半衰期、增加对纤维蛋白的亲和力及提高对纤溶酶原的催化活性等方面均有较大改善，较之天然的tPA有更广阔的应用前景。 在本项研究中，通过利用缺失与突变等分子生物学手段对tPA进行改构，在毕氏酵母表达体系中构建了具有生物活性催化结构域的tPA突变体表达质粒，成功实现了对其的高效表达。此外，我们还通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对重组蛋白的肽段进行质量指纹谱的识别鉴定；通过纤维蛋白－琼脂糖平板分析其生物活性；通过发光底物测定其相关的酶动力学参数。这些工作均为丝氨酸蛋白酶的大分子晶体结构研究；tPA及其突变体的结构生物学研究及生产应用；临床上开发和应用半衰期长、出血倾向低、特异活性高、价格低廉的新型tPA提供理论基础。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-05-09 |
| 页码 | 66 |
| 源URL | [http://ir.fjirsm.ac.cn/handle/350002/7618]  |
| 专题 | 福建物质结构研究所_中科院福建物质结构研究所_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 曾途. 组织型纤溶酶原激活物突变体在毕氏酵母中表达、纯化及生物学研究[D]. 福建物质结构研究所. 中国科学院福建物质结构研究所. 2008. |
入库方式： OAI收割
来源：福建物质结构研究所
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